Способ получения модулятора циклонуклеотидзависимых протеинкиназ

О П И С А Н И Е о 1)828294ИЗОБРЕТЕНИЯ Союз Советских Социалистических Республик(23) Приоритет -Государственный комитат СССР по долам изобретений и открытий(45) Дата опубликования описания 07.11.81(71) Заявитель Научный центр биологических исследований АН Азербайджанской ССР(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МОДУЛЯТОРА ЦИКЛОНУКЛЕОТИД - ЗАВИСИМЫХ ПРОТЕИНКИНАЗИзобретение относится к области биохимии и может быть применено для получениях белковых модуляторов ферментов,Известен способ получения модулятора циклонуклеотид - зависимых протеинкиназ путем гомогенизации хвостовых мышц омара, тепловой обработки супернатанта, осаждения надосадочной жидкости трихлоруксусной кислотой, двухкратного осаждения сульфатом аммония с последующей хроматографией на диэтиламиноэтилсефадексе и гель-фильтрацией,Однако известный способ является трудоемким и длительным.Цель изобретения - упрощение способа и расширение сырьевой базы,Поставленная цель достигается тем, что гомогенизации подвергают хвостовые мышцы креветок, после центрифугирования полученный раствор подвергают тепловой обработке, повторно центрифугируют, осаждают надосадочную жидкость трихлоруксусной кислотой, двухкратно осаждают сульфатом аммония с последующей хроматографией на диэтиламиноэтилсефадексе и гель-фильтрацией,Способ осуществляют следующим обобразом.Гомогенизацию 500 г; хвостовой мышцы креветки проводят в 4 мМ нейтрали. зованной этилендпамминтетрауксусной кислоте в соотношении один объем ткани на пять объемов раствора.Гомогенат центрпфугируют прп 6000 д 5 в течение 30 мин. Избавившись от осадкацентрифугированием, супернатант кипятят 15 мпн. прп непрерывном перемешивании, После охлаждения на льду раствор цен.трифугируют при 3000 д в течение 20 мин, 10 отделяют осадок, раствор пропускают через ватный фильтр, К отфильтрованному раствору добавляют по каплям при пн.тенсивном перемешивании 50%-ную три.хлоруксусную кислоту в соотношении 1 объем кислоты на 9 объемов раствора.Смесь центрифугируют при 6000 д 15 мин. Осадок собирают, суспензируют и холодной дистиллированной воде, рН ра створа доводят до 7,5 5 н. ИаОН. Получен ный раствор диалпзуют против дистиллированной воды с двухкратной сменой воды в течение 18 ч.Модулятор, полученный на этой стадииназывается грубым модулятором.25 К дпалпзованному раствору добавляюткристаллический сульфат аммония 10 г. на 100 мл. раствора. Раствор центрифугируют прп 6000 д 30 минут. К супернатанту добавляют сульфат аммония до конечЗ 0 ной концентрации 40 г на 100 мл. раствора,878294 Формула изобретения Составитель В, Брусиловская Техред Л. Орлова Корректор С. Файн Редактор И. Марголис Заказ 1322/1032 Изд. М 548 Тираж 694 ПодписноеНПО Поиск Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж.35, Раушская наб., д. 4/5 Тип. Харьк. фил, пред. кПатент После 30 мпн. псремешигания раствор центрифугируют прп 6000 д 30 мин, Осадок растворяют в 5 мМ калий-фосфатном буфере и диализуют против того же буфе. ра в соотношении 1; 100 с :;. ухкратной 5 сменой буфера в течение 18 ч.На колонку с диэтиламнпоэтил-сефадексом А, уравновешенную 5 мМ калий-фосфатным буфером с рН 7,0, наносят диализованный материал из предыду О щей стадии. Колонку промывают 100 мМ калнй-фосфатным буфером с рН 7,0. Модулятор вымывают из колонки 300 мМ калий-фосфатным буфером с рН 7,0, затем полученный препарат модулятора кон центрируют путем, добавления к раствору сульфата аммония из расчета 40 г. сульфата аммония на 100 мл раствора, Раствор центрифугируют при 600 д, осадок собирают и диализуют протйв 5 мМ калий-фос фатного буфера в соотношении 1: 100 в течение 12 ч. Диализованный раствор наносят на колонку с диэтпламиноэтил-сефадексом Г(2,5 Х 100 см), уравновешанную 5 мМ калий-фосфатным буфером 25 рН 7,0. Модуляторы вымывают тем же буфером, Из 500 г. хвостовой ткани креветки получили 24 мг, модулятора. Предлагаемый способ расширяет сырьевую базу и позволяет упростить технологию получения модулятора ферментов. Способ получения модулятора циклонуклеотид в зависим протеинкиназ путем гомогенизации животного сырья, тепловой обработки, центрифугирования, осаждения надосадочной жидкости трихлоруксусной кислотой, двухкратного осаждения сульфатом аммония с последующей хроматографией и фильтрацией, о т л и ч аю щ и й с я тем, что, с целью упрощения способа и расширения сырьевой базы, в качестве источника сырья используют хвостовые мышцы креветок и хроматографию проводят на диэтиламиноэтилсефадексе с последующей гель-фильтрацией.Источник информации, принятый во внимание при экспертизе;1. Г. Е. Роппе 11 у е 1 о 11 Рго 1 е 1 п К 1 пазе Модц 1 а 1 ог гогот 1.оЬз 1 ег Та 1 Мцзс 1 е, Яоцгпа 1 о 1 В 1 о 1 орса 1 С 11 егпЫгу, ю 1. 248, Ва- .ппоге 115 А, 1973, р. 190 - 198,