Способ получения лейкоцитарногоинтерферона

ОПИСАНИЕИЗОБРЕТЕНИЯК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ Союз Советских Социалистических Республик(22) Заявлено 0604,79 (21) 2750539/28-13 с присоединением заявки Ко 2750538/28-13 (23) ПриоритетОпубликовано 230681, Бюллетень Ио 23 рцм з А 61, К 45/02 Государственный комитет СССР ио делам изобретений и открытийДата опубликования описания 230681.Ь. Монастырева,. А.В. Киктенко, В,В. Парфе И.И. Бухарова и Н.К. Преображенская изобретени сесоюзный научно-исследовательский и биологического приборостроения Р 1) Заявитель 4) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛЕЙКОЦИТАРНОГО ИНТЕРФЕРОНЪмл в ием 1Изобретение относится к медицине, а именно к получению лекарственнопрофилактических препаратов.Известен способ получения лейкоцитарного интерферона заражением лейкоцитов человека вирусом-индукторомс последующей инкубацией и выделением целевого продукта .11 .Цель изобретения - расширение сырьевой базы.Эта цель достигается тем, что для заражения используют лейкоциты крови свиней и инкубируют в среде, содержащей амниотическую жидкость.Способ осуществляется в несколько этапов.П р и м е р, На 1 этапе получают свиные лейкоциты. Для этого кровь свиней используют не позднее 3-4 ч после ее взятия от животных. Для предотвращения свертывания крови используют гепарин. Для лизиса эритроцитов кровь смешивают с четырехкратным объемом 0,83-ного раствора хлористого аммония, 10 мин. выдерживают в холодильнике при +40 С, затем центрифугируют при 1000 об/мин в течение 10 мин для отделения лейкоцитов от продуктов гемолиза и плазмы. Процедуру повторяют, затем осадок лейкоцитов суспензируют в среде 199 с 10 амниотической жидкости коров (АМЖ) доконцентрации 10 млн. клеток в 1Эти процедуры, как и все последующие операции, проводят с соблюденправил стерильной работы.На 1 этапе осуществляют биосинтез интерферона. Для этого всуспензию лейкоцитов вносят индуктор интерферона - вирус болезниНьюкастла (ВБН) .вакцинный штамм"Н" в дозе 10-100 ЦПД 5 она клетку иинкубируют 18-20 ч при 37 С. Затем 15 центрифугируют для отделенияклеток от культуральной жидкости иинактивируют вирус-индуктор доведением рН жидкости с помощью 25-нораствора НС 1 до 2,2-2,4, выдержи вают ее при этом рН в холодильнике при +4 оС в течение 4 суток.После инактивации рН восстанавливают до 7,2-7,4 с помощью 20- ногораствора иаОН и сохраняют в условиях холодильника до моментаопределения титра интерферона.Если в процессе биосинтеза интерферона используют прайминг-метод, то период внесением вируса-ин дуктора в суспензию лейкоцитов вно839547 при условии наступления полной дегенерации клеток в контрольных про.бирках с культурой ткани, не обработанной интерференом, но инфицированной вирусом, определяютпоследнее разведение интерферона,защитившее клетки от вирусной деструкции. Это разведение принимают за титр интерферона и выражаютего в единицах международного стандарта Б 69/19.Средний титр свиного лейкоцитарного интерферона в культуредиплоидных клеток человека 400 М.ед/млв том случае, если интерферон получают без применения прайминг-ме 15 тода., а при использовании его 10000 М.ед/мл.В таблице представлена сравнительная характеристика свиного и человеческого лейкоцитарного интерферо 20 нов,Среда 199 с 10 АМЖ Среда 199 с 10 сы- воротки Лейкоциты кровиТитр Количество активности, белка, М.ед/мл мг/мл Количество белка, мг/мл Титрактивности, М.ед/мл 7,43+0,62 2676+298 0,50+0,12 Человека трупные) 2304+404 1536+362 3328+721 0,49+0,13 Пуаовинные 6,52+0,6 8,1+0,58 4835+814 0,70+0,12 1333+420 Свиньи Предлагаемый способ позволяет получить интерферон, активный у челове" ка, повысить качество интерферона за счет снижения содержания балластных белков и расширить сырьевую базу,Формула изобретения Способ получения лейкоцитарногоинтерферона,путем заражения лейСоставитель С. Малютина Редактор О. Черниченко Техред С.Мигунова Корректор В. МакаренкоЭаказ 4584/5 Тираж 687 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж,.Раушская наб., д.4/5Филиал ППП "Патент", г,ужгород, ул.Проектная, 4 сят свиной лейкоцитарный интерферон в количестве 100 ед. на 1 мл суспензии. Смесь инкубируют 2 ч при 370 С, затем центрифугируют для отделения клеток от среды, клетки вновь суспензируют в свежей среде 199 с 10-ной АМЖ, после чего в суспензию вносят вирус-ин,дуктор. Титр ВБН определяют предварительно в культуре куриных фибробластов.на 111 этапе определяют антивирусную активность, Двухкратные разведения интерфероносодержащей жидкости вносят в пробирки с трехдневной культурой диплоидных клеток человека и через 18-20 ч инкубации при 37 бС в те же пробирки вносят вирус-индикатор (вирус веэикулярного стоматика ВВС, штамм "Индиана) в дозе 100 ЦПДВО на пробирку. Через 48 ч инкубирования при 37 эС,коцитов крови вирусом-индуктором с оследующей инкубацией и выделеницелевого продукта, о т л и ч аю щ и й с я тем, что, с целью расширения сырьевой базы,для заражения используют лейкоциты крови свиней и инкубируют в среде, содержащей амниотическую жидкость.Источники информации, принятые во внимание при экспертизе1. Авторское свидетельство СССР Р 297296, кл. С 12 К 5/00, 1970.