Способ получения протопластов растений

Союз Советских Социалистических Республик(51)М. Кл.2 А 01 С 7/ОО Государственный комитет СССР по делам изобретений н открытий(53) УДК 576. 311 с 543,9(088.8) Опубликовано 28.02.80. Бюллетень йо 8 Дата опубликования описания 290280( 54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОТОПЛАСТОВ РАСТЕНИИ Изобретение относится к общимвопросам ботаники и может быть использовано в области генетики, селекции, физиологии растений и Фитапато- .логии,Известны способы выделения протопластов из растений, основанные на использовании пектоцеллулолитическихферментных комплексов, растворяющихклеточную стенку. При этом отрезкилистьев или других органов растений,помещенные в совтветствующий ферментный раствор, инкубируют определенноевремя в темноте при 21-26 аС, Затемживые протопласты, вышедшие в раствор, отделяют путем центрифугирования от остатков тканей и разрушенныхклеток, после чего их используйт вразличных целях (13 (.2 и (3)Известен способ выделеййя НрОтб"пластов с помощью Ферментного комплекса Целлулизин ТМ (Се 1101 увЗпТМ) выпуСкаемого Фирмой (Са 1 Ь 1 осйетп, при котором ферментативнуюобработку листьев проводят при 24 оСв 1-ном растворе целлюлизина 14),Однако целлюлолитическийфкомплексповреждает илн разрушает определен"ное количество клеток, так как Фер"ментатнвная обработка проводится в относительно концентрированном раст-воре целлулизина и при температуре,оптимальной для всех биохимическихпроцессов, в том числе и для реакций, связанных с повреждением клеток.Целью изобретения является повышение качества протопластов при ихполучении из растений.Цель достигается тем, что для получения протопластов обработку Ферментным комплексом (например, цел-лулизином ТМ) проводят в интерваленизких положительных температур4-16 оС, а концентрацию Ферментногопрепарата варьируют в пределах0,05-0,5 в зависимости от условийработы,Понижение температуры и уменьшение концентрации ферментного препарата снижают его токсическое действие на живые клетки, благодаря чему повышается качество протопластов.Изобретение основано на выявленном свойстве плазмелемм растительных клеток по-разному реагироватьна воздействие повреждакщих Факторов (например, повреждающих компонентов Ферментного препарата) в зависимости от некоторых условий, в718052 Формула изобретения 55 ЦНИИПИ Заказ 9980/5 Тираж 723 Подписное Филиал ППП Патент, г, Ужгород, ул. Прбектная,4 частности от концентрации целлулизина и температуры инкубации в йем отрезков -лйстьев.П р и м е р 1 Испьйыают влйя=" ние концентрации целлулизина накачественный выход протопластов, Целлулизин испытывают в концентрициях 0,05, 0,5, 1, 2 и 5. Опыт ставят трижды, в 3-5 повторностях, Отрезки листьев 10-дневных проростков пшеницы сорта Капли после уДаления эпидермиса с нижней стороны листа -помещают в бюксы на поверхность "0,28 М СаСУ, содержащего целлулизин в одной из:указанных концентраций, Каждый бюкс диаметром 30 мм содер-. жит. 1,5 мл такого раствора. В каждом бюксе .учитывают навеску листьев, Инкубацию проводят в термостате при 25"С в течение 3 ч. По ее окончании бюксы осторожно встряхивают для рав-.: ноМерного распределения протОплас-,20 тоз в объеме раствора и пипеткой отбирают пробу для подсчета клеток к камере Горяева. Подсчет клеток осуществляют каждый раз в объеме 0,9 мм. Результаты показывают, что 2 Я количественный выход протопластов иэ 1 г листьев при повышении концентрации целлулизина от 0,5.и вйшесущественно не увеличивается. Некоторое его увеличение при концентрации З 0 фермента 5 сопровождается резким увеличением количества поврежденных и Разрушенных клеток. В связи с этим концентрацйя целлулизина 0,5 была оценена как опти=, мальная.П р и м е р 2. Изучают влияние температуры, при которой пройсхо- дит инкубация листьев в ферменте, 40на качество получаемых протопластов. После удаления эпидермиса с нижней стороны. отрезки листьев 10-,дневных " проростков пшеницы сорта Каплипомещают в бюксы на поверхность 0,5 целлулизина, растворенного в 0,28 М СаС 2 . Инкубацию проводят в следующих условиях:1 вариант: при 4 С,17 ч; 11 вариант: при 16 ОС, б ч;П 1 вариант: при 25 ОС, 2 ч, Колй" 50чество выделившихся во всех вариан"тах протоплстов находится в пределах 5 10 ф10 шт в 1 мл раствора.,Анализ.кажд ого варианта осуществляют в; 5-7 повторностях. Опыт ставят четыре разаНаблюдения показывают,что все выделившиеся в раствор клетки можно подразделить на 3 типаг нормальные сферические протоплас- ты поврежденные протопласты (правильная сферическая форма часто утра 4чена, в месте повреждения на плазмалемме имеются выпуклости, куда стягивается значительная часть цитоплаэмы, заметна деструкциячасти хлоропластов или их выход из клетки в мес"те повреждения плаэмалеммы;разрушенные протопласты,При анализе и подсчете число поврежденных и разрушенных протопластов объедяниют вместе в графу Дефектные протопласты, Для нормальных протопластов вычисляют. их процентную долю от общего числа.Данные опыта показывают, что понижение температуры инкубации до 4 Сповышает выход неповрежденных протопластов почти на 20. Увеличение доли нормальныхпротопластов (11) даеттакже снижение температуры инкубации с 25 до 1 бфС.Аналогичйыв результаты получаютв опытах с протопластами из проростков овса,Применение иЗЬбретения позволитповысить -выход неповрежденных протопластов на 11-20, а также повыситьтехнологичность работ, связанных сего йспользованием, поскольку изменения температурного режима и концентрации фермента позволяют варьироватьвременем инкубации. Способ получения протопластов растений, включающий отделение или надрезание эфидермиса и инкубацию отрезков органов в расвторе ферментного пектоцеллюлолитическбго комплекса, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что,с Целью повышения качества протопластов, инкубацию проводят при 4-1 боС .и концентрации ферментногокомплекса 0,05-0,"5.Источники информации,принятые во внимание при экспертизе1. Иа 1 сава К. 1 во 1 а 11 оп оЕ рго 1 ор 1 авСв агою уаг 1 оцв р 1 апС огдапв.Зарап 3. Сепе, 1973, 48: 279-289,2, Глеба Ю.Ю., Сытник К.М., Изолированные протопласты высших растений и конструирование растительнойклетки. Киев, Наукова думка,1973.е3. Герасимов С.Б, Новый способ получения й:.,отопластов растений.-До"клады ВАСХНИИЛ, 9 3, 1976, с. 22-23.4.Вгеппевап Р.И., Са 1 всоп А.М.В 1 осйеш 1 е цпй Рпув 1 о 1. дег РЙ 1 апдеп,1975, 168;453-471 прототип).