Способ получения диагностикума для выявления псевдотуберкулеза

Заявпено 14.08.74 (21) 2053690/13 5/ присоединением за осударственныи иомитеСовета Министров СССРпо делам изобретенийи открытий(43) Опубликовано 30,09,76 Бюллетень3 ДК 616-097:616002,7 1 (088,8) о) Дата бликования описания 03.12.7(72) Автор изобрет Дзадзие падивостокский научно-исследовательский институ эпидемиологии и микробиологии(71) Заявитель 54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДИАГНОСТИКУМА ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ПСЕВДОТУБЕРКУЛЕЗА2 ные способы н вствитепьности обеспечи- специфич- обладают ают высок ности пр высокой цепь тепьностарата. Кзобретенияи специ е того,ь высить чувст фичнссть препарата. я тем, что выращеннуюют от токсических поверх достиг ае у отдепя куль Изобретение относится к микробиологии и касается выделения биологически активных комплексов из бактериальной клетки.Известен способ получения диагностикума дпя выявления псевдотуберкупеза, закпючающийся в том, что исходную культуру выращивают на плотной среде, суспензию микрооргоанизма прогревают в течение 1,5 час при 100 С, отделяют осадок, надоса дочную жидкость используют дпя се лизации эритроцитов,Известен также способ попучения диагностикума дпя выявления псевдотуберкупеза путем выращивания культуры псевдотуберкупезных бактерий на питательной среде, их обезвреживания и выдепения цепевого продукта.Однако известе ностных субстанций, обезвреживание ведутацетоном и целевой продукт выдепяют экстракцией мочевиной.П р и м е р. Производят посев на 30матрасов объемом 2 л с мясо-пептоннымагаром (МПА) 250 мл суточчой культуры.рьец дои БегсиГоь в 5 мл стерипьногофизиологического раствора и выращиваютобактериапьную массу при 22-24 С в течение 48 час.Бактериапьную массу смывают и трехкратно от экстрацелпюпярных компонентовстерильным физиологическим раствором центрифугированием со скоростью 6000 об/минв течение 30 мин,Отделение жгутиков и поверхностныхтоксических субстанций проводят на дезинтеграторе (встряхиванием бактерий в кончцентрации 2 10 в стаканах порциями по30 мп в течение 15 мин) с поспедующимотдепением осадка центрифугированием соскоростью 6000 об/мин в течение 30 мин,Полноту снятия капсупы контролируют мазком с окраской по Бурри. Обезвреживаютоставшуюся бактериальную массу ацетоном529833 Составитель С. МалютинаРедактор М. дмитриева Техред Н, Андрейчук Корректор С. Болдижар Заказ 5209/9 58 Тираж 630 Подписное 1 НИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская набд, 4/5филиал ППП фПатентф, г, Ужгород, уп. Проектная, 4 в соотношении 1:10 с выстаиванием в холодильнике в течение суток. Стерильность суспензии контролируют посевом на чашки Петри с МПА, Отдепение ацетона производят центрифугированием со скоростью5 3000 об/мин в течение 20 мин. Затем бактериальную массу высушивают в вакууме или на воздухе.После этого белки трехкратно экстрагируют стерильным 2,5%-ным раствором поварен 10 ной соли (20,15 и 10 объемами по отношению к объему "ацетонового" порошка бактерий с выстаиванием в рефрижераторе, по 24 час) с предварительным встряхиванием в течение 30 мин на Шуттепь-аппарате.ь Копсервируют растворы топуопом, Осадок отделяют центрифугированием со скоростью 6000 об/мин в течение 30 мин. Бактериаль ный остаток экстрагируют стерипьным 2,5 М раствором мочевины (1:20) в тече- О нпе 7 час с периодическим встряхиваниемов термостате при 38 С. Консервируют толуопом (5 капель на 1 и жидкости), Осадок отделяют центрифугированием, Диализ суперпатанита производят в холодильнике на у магнитной мешалке против дистиллированной воды до отрицательной реакции на мочевину с нитропуссидом натрия, Полученное вешостио пиофипизируют.ЗЯект иммунизации против инфекции 9. резусОЬп Оесо 1 оь ьПрепарат в концентрации 500 мкг в мп растворяют в стерильном физиопогическом растворе, фильтруют через мембранные фильтры ЛЪ 2 (поры 213 ммк). Белых мы- З шей весом 12-14 г иммунизируют подкожно в дозе 0,1 мл (50 мкг). Через 14 дней животных заражают внутрибрюшинно 10 о (10 смертепьных доз) в 0,1 мл физиологического раствора вирулентной купьтурой 4 О 9. рьец 1 оиЬепси 1055, Контрольных животных заражают той же дозой.Обо группы мышей наблюдают в течение 21 дня. Иммунизированные мыши выживают в 90% случаев, контрольные - погибают 45 в течение 1520 дней.Определение сенсибилизируюшей активности липопротеинопописахаридного (ЛППС) комплекса , рье и ба ц Ье гс и оь ЬПрепарат растворяют в физиологическом 6 О 4растворе на фосфатном буфере рН 7,2 в концентрации 100 мкг в мп. Формапинизированные эритроциты барана или человека 1 (О) группы, обработанные по известному способу .пД)и Ь йгп 1965, сенсибилизируют приготовленным раствором в течеоние 2 час в термостате при 37 С с периодическим встряхиванием. От избытка ЛППС комплекса трехкратно отмывают физиологическим раствором с добавлением 1% нормальной кроличьей сыворотки (центрифугированием со скоростью 1500 обЫин в течение 20 мин), Сенсибипизированные таким образом эритроциты человека ипи животных применяют для реакции непрямой гемаггпютинации по известному способу.Определение антигенных свойств ЛППС комплексаПрепарат, разведенный в физиологическом растворе, стерилизуют фильтрацией через мембранные фильтры Л 2 (213 ммк) и вводят внутривенно кроликам весом 0,5 кг из расчета 35 мкг на кг веса, Кровь дпя исследования на наличие антител берут накануне инъекции, через 3,7,14, 28 и 60 дней, Титры антител определяют в реакциях агглютиации, непрямой агглютинации, бактериального лизиса (РАРНГА и РБЛ).Полученный препарат найдет применение в получении гипериммунных сывороток: приготовлении эритроцитарного диагностикума, крайне необходимо дпя диагностики псевдо- туберкулеза человека (дальневосточной скарцатиноподобной лихорадки), а также как иммуногенный аппарат в борьбе с инфекцией. формула изобретения Способ получения диагностикума дпя выявления псевдотуберкулеза путем вырашивания культуры псевдотуберкупезных бактерий на питательной среде, их обвзвреживания и выделения целевого продукта, о т и и - ч а ю щ и й с я тем, чтос цепью повышения чувствитепьности и специфичности препарата, выращенную культуру отделают от токсических поверхностных субстанций, обвзвреживание ведут ацетоном и выделяют целевой продукт экстракцией мочевиной.