Способ определения гистонов

О П И С А Н И Е (11)423026ИЗОБРЕТЕ Н ИЯ Союз Советскил Социалистических Республик(32) ПриоритетОпубликовано 05.04.74, Бюллетень13Дата опубликования описания 10.09.74 51) М. 1 п 2 Государственный комитетСовета Министров СССРло делам изобретенийи открытий-074 (088.8) 72) Авторы изобретения В. А, Шляховенко и Г. 3. Негрей нститут проблем онкологии АН Украинской С71) Заявител СТОНО 54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕН Изобретение относится к медицине и можетбыть использовано в цитологии, генетике и биохимии.Известен способ определения гистонов путем их электрофоретического разделения и 5 выявления белковых зон красителем амидочерным. Однако этом способ не позволяет выделять фракции с определенным аминокислотным составом.Целью изобретения является обнаружение т 0фракции гистонов, богатой лизином. Для этого электрофореграммы, отмытые от избытка амидо-черного, обрабатывают в растворе частично полимеризованного красителя тиазинового ряда, например, толуидинового синего. 15П р и м е р 1. На первом, этапе известным образом получают электрофореграмму гистонов на 15%-ном полиакриламидном геле, которую окрашивают в 1%-ном растворе амидо-черного в смеси метанол - уксусная кислота - вода 20 (в соотношении 5:1:5) в течение часа при комнатной температуре. Затем блок геля с проявленной электрофореграммой отмывают от избытка амидо-черного в 1 н. растворе уксусной кислоты в течение 24 - 48 час, меняя экстрагирующую среду через каждые 3 - 4 час. Конец экстракции определяют визуально по достижению бесцветного фона.Дальнейшую обработку проводят следующим образом, 30 В 100 мл дистиллированной воды вносят 50 мг толуидинового синего (ЧДА) и перемешивают при нагревании или выдерживают при комнатной температуре несколько суток. В полученньш 0,05%-ный раствор микропипеткой по капле вносят 0,15 - 0,20 мл 0,1%-ного раствора рибонуклеиновой кислоты (РНК) в 0,05 М ацетатом буфере рН 5,5) встряхивая до выпадения частично полимеризованного на РНК красителя в виде фиолетово-синих хлопьев, Суспензию выдерживают в течение часа при комнатной температуре, после чего осадок отделяют центрифугированием, дважды промывают водой, заливают осадок 1 н, раствором уксуоной кислоты и через 1 - 2 час смесь вновь центрифугируют, отбрасывая осадок, Полученньш прозрачный раствор готов к использованию для окраски электрофореграмм.В указанный раствор погружают блок полиакриламидного геля, полученного на первой стадии, на 1 - 2 часа, отмывают в 1 н. растворе уксусной кислоты в течение 12 - 24 час, меняя среду через каждые 3 - 4 час, и используют для анализа известным образом, Богатые лизином фракции гистонов имеют красно-фиолетовый цвет на фоне темно-синих зон, свидетельствующих о присутствии прочих белков.П р и м е р 2. Все операции по подготовке электроферограммы, окрашенной амидо-чер423026 Составитель С. ЩеневаТехред Л. Богданова Редактор Т. Каранова Корректор М. Лейзерман Заказ 2309/10 Изд, Ма 703 Тираж 651 11 одписиое ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5Типография, пр. Сапунова, 2 ным, и их обработке раствором частично по; лимеризованного красителя тиазинового ряда производят, как в примере 1.Раствор красителя приготовляют следующим образом (по экспресс-методу). Известным образом готовят блоки чистого 10 - 15 о - ного полиакриламидного геля объемом 2000 - 2500 мм в виде прямоугольных параллелепипедов, (в данном случае размер бОХ 20 М 2 мм), которые в течение 30 - б 0 мин пропитывают 0,5 -ным раствором РНК в ацетатном буфере, после чего быстро споласкивают водой. Затем эти блоки на 20 мии погружают в 0,05 о -ный водный раствор толуидинового синего и вновь споласкивают водой, После выдерживания в течение часа обработанных таким образом блоков в 1 н. уксусной кислоте получают требуемый,реактивов в виде раствора. В этом случае яркость окраски по сравнению с результатами обработки по примеру 1 повышается. Упрощается и ускоряется процесс подготовки окрашивающего раствора.5 Срок хранения в среднем 3 - 4 недели, возможно использование в течение трех месяцев.Готовые электрофореграммы хранят в 1 н.растворе уксусной кислоты. Предмет изобретенияСпособ определения гистонов путем ихэлектрофоретического разделения и выявления белковых зон красителем амидо-черным,отличающийся тем, что, с целью обнару 15 жения фракции гистонов, богатой лизином,электрофореграммы, отмытые от, избытка амидо-черного, обрабатывают в растворе частичнополимеризованного красителя тиазинового ряда, например, толуидинового синего,