Способ получения меченного тритием гуанозин-5-трифосфата

Союз Советских Социалистических РеспубликОП ИСАНИЕИЗОБРЕТЕН ИЯ К АВТОРСКОМУ СВИДВТВЛЬСТВУ(45) Дата опубликования описания 14,02.7 Государственный комит Совета Министров ССС по делам изобретений и открытий) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МЕЧЕННОГ ГУАНОЗИН-ТРИФОСИТИЕ Для этого 8-бромгуанозин, абсорбирован ный на палладиевом катализаторе, подвергают обработке газообразным тритием в условиях высокочастотного электрического разряда с промежуточным выделением меченного гуанозина - 8-(Т) и последующей радиохимической очисткой гуанозина (Т), совмешенной со стадией фосфорилирования.Обычно гуанозин(Т) выделяют на смоле О,ауэкс 1 х 8 в формиатной форме элюаций 0,1 М растьороммуравьинойпосле чего его концентрируют приактивированного угля.Продукты фосфорилирования гуанозина- -8(Т) обычно разделяют хроматографией на ионообменном сефадексе Ав бикарбонат ной форме при помощи триэтиламмоний -би - карбонатного буфера.1Выход гуанозин-трифосфата - 8(Т) по активности составляет 50% (в расчете на промежуточный гуанозин - 8(Т) ).Преимушеством предложенного способа является то, что основная масса пос онней радиоактивности, не связанной с гуанозином, сбрасывается при выделении гуано -кислоты,помощи тор Изобретение относится к улучшенномуспособу получения меченного тритием био;югического соединения, которое может найти применение для биологических и биохимических исследеваний, 5Известен способ получения меченногоС гуанозин-трифосфата, заключающий 14 1ся в том, что выращивают культуру микро организмов на среде, содержащей С 0,выделяют из биомассы меченую РНК, гидролизуют ее до нуклеотидов, разделяют ихс последующим биохимическим фосфорилированием меченого гуанозин -монофосфа/та до меченого гуанозин-трифосфата.Однако известный способ получения меченого гуанозин-трифосфата позволяет получить целевой продукт тольконизкой удельной активности (не более 50200 м кюри/г) и с очень незначительным выходом (по суммарной активности), 20При этом метка по молекуле гуанозин --5 -трифосфата распределена неопределенно.1Целью изобретения является повышениеудельной активности и радиохимической чистоты,ихайлэв у О с;404348 3зина(Т). Дополнительная радиохимическая очистка происходит при концентрировании гуанозина( Т) на активированном угле, Наконец, наиболее тонкая и сложная очистка от продуктов радиационного поврен у дения гуанозина, хроматографически сходных с гуанозином, совмещена с процессом биохимического фосфорилирования.Благодаря высокой специфичности фермента к субстрату, радиационно-поврежден-. р ные молекулы не фосфорилируются и связанная с ними активность легко сбрасывается в процессе разделения продуктов фосфорилирования,П р и м е р . 145 мг 8-бромгуанози- р на наносят на 600 мг катализатора (10% Р на угле "Норит"). Тритирование проводят в стеклянной ампуле со впаянным электродом, вокруг которого помешают нанесенный на стеклянную вату катализатор с 8- 0 -брэмгуанэзинэм. Прэдэлжительнэсть тритирования в атмосфере 99%-го трития в условиях высокочастотного электрического разряда составляет 20 мин. Температоура в ампуле в процессе тритирования 120-130 С. По окончании процесса вещество смывают с катализатора 60 мл спиртоаммиачной смеси (1 М раствор Й Н в 50%-м спирте) и лабильн й тритий замещают на водород путем повторного изотопного уравновешива ния с водой, Сухой остаток после отгонки последней порции воды растворяют в 20 мл дистиллированной воды и вводят в колонку с Дауэкс 1 х 8 в формиатной форме (Зх 30 см), Колонку промывают - 250 мл дистил- М лированной воды, а затем выделяют гуанозин(Т) в виде четкого пика при элюации - 300 мл 0,1 М муравьиной кислоты, Далее выделяют 8-бромгуанозин-Т ( Ч ), используя для элюации 0,2 М муравьиную кис- Ф логу. В эксперименте получается - 30 мг гуанозина(Т) с удельной активностью 10 кюри/г (т,е, 300 м кюри), и 40 мг 8- -бромгуанозина-Т ( 0 ) с удельной активностью1 хюри/г (т.е, - 40 мкюри). Полученный препарат гуанозина(Т)концентрируют при помощи активированногоугля и фосфорилируют (используя 10 млфермвнтного раствора до гуанозин-трифосфат(Т) ГТф(Т) ), Продукты фосфорилирования разделяют на колонке (1,5 х 21 см),заполненной сефадексом Ав бикарбонат -ной форме. Для элюции применяют градиент концентрации триэтиламмоний-бикарбоната (от 0,2 Мдо 0,6 М). Соответствующие фракции собирают, обессоливают при помощи сефадексаС(в Н-форме) и концентрируют выпа -риванием в вакууме. В результате эксперимента получают 55 мг ГТФ(Т) с удельной активностью 2,8 кюри/г (т.е.-трифосфат(Т) хроматографически однороден и радиохимически чист,форм ула изобретения Способ получения меченного тритием гуанозин-трифосфата биохимическим фосгфорилированием меченного гуанозина с последующим выделением целевого продуктаизвестным способом, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью повышения удельной активности и радиохимической чистэты8-бромгуанозин, абсорбированный на палладиевом катализаторе, подвергают обработкегазообразным тритием в условиях высокочастотного электрического разряда с промежуточным выделением меченэгэ гуанозина(Т) и последующей радиохимическойочисткой гуанозина(Т), совмещенной состадией фосфорилирования, Составитель В. ЖесгковРедактор С, Осганине Техред Г. Родак Корректор Н. БабуркаЗаказ 5442/171 Тираж. 575 П одписн ое ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д.4/5 филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4