Способ препаративного электрофореза

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ Союз Советских.Социевистических Ресоубвик Зависимое от авт. свидетельстваКл, 421, 3/06 Заявлено 24,1.1968 ( 1214438/23-26)с присоединением заявкиПриоритетОпубликовано 06,1,1970, Бюллетень4Дата опубликования описания 5 Х 1970 МПК С 01 пУДК 543.545(088,8) Комитет ко девам изобретеиий и открытий ори Совете Мииистрое СССРАвторизобретения В. Л, Волжин Заявитель СПОСОБ ПРЕППАРАТИВНОГО ЭЛЕКТРОФОРЕЗА Изобретение касается способа электрофореза (разделения веществ в электрическом поле).Известен способ препаративного электрофореза, заключающийся в том, что препаративное выделение веществ из колонки, заполненной гелем, с электрическим полем, наложенным в осевом направлении, возможно элюированием через узкую проточную кювету, расположенную поперек колонки, При этом наблюдается малая разрешающая способность, т, е. разделение ограниченных количеств веществ (например, не более 100 иг белков). Кроме того, применяют полупроницаемые мембраны для ограничения проточных кювет, на которых сорбируется часть разделяемых веществ.По предлагаемому способу элюирование разделяемых компонентов ведут не в поперечном, а в осевом направлении колонки. Подача буфера, введение электрода в проточную кювету и отвод образующихся газов осуществляют с помощью осевой трубки. Для обеспечения надежного обмыва электрода, находящегося в непосредственной близости ог осевого выходного отверстия колонки предлагают прерывистый режим электрофореза. При прерывистом режиме электрофореза питание электродов осуществляют лищь в начале образования капли. Осевое элюирование и отсутствие полупроиицаемых мембран позволяет работать в более широких колонках с болыпими количествами вещества и лучшей разделяющей способностью.Пример, Проводят разделение суммарных 5 белков фасоли сорта Сакса, экстрагированных трис-глициновым буфером с р 1-1 8,3.Диаметр опытной колонки на выходе 50 мм(приборы, выполненные по способу поперечной проточной кюветы, имегот колонки диаметром 10 не более 20 лтги), в средней части колонки -70 мха. Высота полиакриламидного геля 8 сд (7 сл 7,5 огель+1 сл 3,5% гель).150 - 160 чг белка (рассчитан по азоту) наносят в смеси с линейным полимером акрила мида. Элюирование проводят трис-глициновымбуфером, разбавленным вдвое, по сравнению с взятым для экстракции.Около 30 час приоор рабогает в постоянномрежиме электрофореза для разгонки белка, за тем еще свыше 150 час - в прерывистом рекиме с элюированием. Скорость элюирования 10 - 15 ил/час. Фракции собирают коллектором ХККВпо 50 капель (около 4 мл). Количество белка в пробирках определяют в 1 лл 25 по Лоури,Соотношение активного и гассивного режимов электрофореза задают 1:1 при времени образования капли около 40 сек.Режим электрофореза: сила тока 20 лба, на- ЗО пряжение 150 - 200 в, Электроды платиновые260953 Составитель Ю. ЕфремовТекред д. В. Куклина Корректор Р. И. Крючков Редакт С. Филиппова а к аз 1033 12 Тираж 499ЦНИИПИ Комитета по делам изобретений и открытий при Совете Минив 1 осква, )К, Раушская наб., д. 4/5 одпнсное ов СССР Гипография, пр, Сапунова, 2 31 анод в проточной кювете точечный - 0,3 см, катод кольцевой). Охлаждение колонки осуществляют водой со льдом. Прерывистый режим поддержива 1 ют автоматически через систему: реле счета капель коллектора - реле 5 времени - магнитный пускатель в цепи анода.В результате разделения получают препаративно 23 компонента, которые идентифицируют кривой, построенной по интенсивности окраски белка по Лоури (с реактивом Фолина), 10 Кроме препаративного выделения, кривая позволила рассчитать фракционный состав исследуемой сложной смеси в процентах от нанесенного белка (по площади пиков).На чертеже изображена полученная кривая 15 элюирования суммарного белка семян фасоли сорта Сакса.Кривая на графике свидетельствует о хорошей разделяющей способности описанного способа. 20С точки зрения особенностей фракционного состава фасоли отмечают, что белковый комплекс ее в основной массе представлен электрофоретически подвижными компонентами с относительно низкими молекулярными весами, так как подвижность белков в полиакриламидном геле зависит от величины молекул и связана с конкурентной гельфильтрацией,Отмечено, что разделяющая способность препаративного электрофореза выше, чем непрепаративного микрометода диск - электрофореза, По собственным данным (литературные данные отсутствуют) микрометодом выявлялось около 1 б компонентов в исследуемой смеси, а препаративным - более 28. Предмет изобретенияСпособ препаративного электрофореза, основанный на разделении компонентов под действием электрического поля в колонке, заполненной гепем, при элюировании разделенных компонентов буфером, огличаюи 1 ийся тем, что, с целью повышения разделяющей способности, компоненты смеси элюируют из кюветы, находящейся под колонкой в осевом направлении при прерывистом режиме элекгрофореза.