Способ деконтаминации от микоплазм тимидинкиназодефектных перевиваемых клеточных линий спэв-тк

(51)5 С 12 И 5/00 ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯК А ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЦТИЯМПРИ ГКНТ СССР(71) Всесоюзный научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. Я.Р.Коваленко (72) Л.П.Дьяконов, О.Ш.Расулев, Е .В.Майджи и ШЛ.Тугизов(56) Неустроева В.В,Контаминация культур клеток микоплазмами, принципы и методы деконтаминации. Дис.канд, наук. М 1969, с,10-150; Изобретение относится к областибиологии, а именно"к культивированию клеток животных 1 п ч 1 сго для вирусологических и биотехнологических исследований.Целью изобретения является повышение степени деконтаминации.П р и м е р 1. Клетки мутантного штамма СПЭВ-А 4-ТК высевают в культуральные флаконы объемом 100 мл в коцентрации 0,5 х 10 кл/мл в ростовую среду, содержащую 200 мкг/мл 5-БДУ 5-бром-дедоксиуридин (5-БДУ), мкг/мл: этоний 10 и кана- . мицин 250. На 10-12 сут культивиро 2(54) СПОСОБ ДЕКОНТАМИНАЦИП ОТ МИКО- ПЛАЗМ ТИМИДИНКИНАЗОДЕФЕКТНЫХ ПЕРЕВИВАЕМЫХ КЛЕТОЧНЕ 1 Х ЛИНИЙ СПЭВ-ТК (57) Изобретение относится к биологии, а именно к культивированию клеток жиВОтных 1 п ч 1 сго для Вирусологических и биотехнологических исследований, Цель изобретения - повышение степени деконтаминации. Способ состоит в комбинированной обработке СПЭВ-ТК-клеток 5-бром-дезоксиуридином (150-250 мкг/мл), этонием (5"15 мкг/мл), канамицином (200 - 300 мкг/мл) на протяжении трех пассажей в ростовой среде, Способ отличается высокой эффективностью деконтаминации СПЭВ-ТК-клеток. На протяЩ жении десяти. пассажей (срок наблюдения) без дальнейшей обработки клетки свободны от микоплазм. вания после формирования очагового монослоя клетки пересевают и повторяют цикл обработки .клеток препаратами второй раз, а затем третий раз. После третьего цикла обработки клеток микоплазмы на элективных пита - тельных средах не вы 1 вляются и результаты по ДНК-флуорохромированию клеток также Отрицательны. При дальнейшем культивировании на протяжении 2 месяцев (10 пассажей) без препаратов и антибиотиков клетки свободны от микоплазм (срок наблюдения).П р и м е р 2. Клетки мутантного штамма СПЭВ-Д 5-ТК высевают в1611929 Формула и з о б р е т е н и яСпособ деконтаминации от мико- плазм тимидинкиназодефектных перевиваемых клеточных линий СПЭВ-ТК включающий обработку клеток в ростовой среде канамицином, о т л и ч а - ю щ и й с я тем, что, с целью повышения степени деконтаминации, клетки обрабатывают канамицином в конечной концентрации 200-300 мкг/мл среды в сочетании с 5-бром-дезоксиуридином с концентрацией 150- 250 мкг/мл среды и этоннем в конечной концентрации 5-15 мкг/мл среды, при этом обработку проводят с интервалом в 10-12 дней. культивирования. Составитель А,МаныкннТехред М,ХоданичКорректор Л, 1 илипенко Редактор Н.Бобкова Заказ 3812 Тираж 486 Подписное ЬНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям п 1 и ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5Производственно-иэдательский комбинат Патент", г.Ужгород;, уя. Гагарина, 101 Культуральные флаконы объемом 100 мл,концентрации 1,0 х 10 кл/мл в ростовую среду, содержащую,мкг/мл: ;5-БДУ 200, этоний 10 и канамицин 250. На 10-12 сут культивирования ,иосле формирования очагового моно- слоя клетки пересевают и повторяют цикл обработки клеток препаратами второй раз, После третьего цикла об О работки клеток микоплазмы на элективньй питательных средах не выявляются и результаты ДНК"флуорохромирования культур раствором Хехсти оливомицином также отрицательны. 15 При дальнейшем культивировании на протяжении 2 мес 10 пассажей) без препа атов и антибиотиков клетки свободны от микоплазм (срок наблюдения).П р и и е р 3, После криогениза цди в течение 1 мес рекультивировали клетки штаммов СПЗВ-А 4-ТК и ;СПЗВ-Д 5-ТК; свободные от мико- ,плазм. На протяжении 5 пассажей (срок наблюдения) клетки обоих штаммов 25 ,культивировали в ростовой среде без антибиотиков, Результаты культивирования микоплазм на элективных питательных средах и ДНК-флуорохромирования клеток раствором Хехсти оливомицином свидетельствуют о том, что клетки штаммов СПЭВ-А 4-ТК и СПЗВ-Д 5-ТК свободны.от микоплазм.1иП р и м е р 4, Клетки двух мутантных штаммов СПЗВ-А 4-ТК и СПЭВ-Д 5-ТК, контаминированных микоплазмами, и тех штаммов, свободных от микоплазм, высевают в концентрации 2,0 х ,х 10 кл/мл в ростовой среде во фла хоны с покровными стеклами. Через 24 ч культивирования проводят слияние клеток в монослое с помощью 50 Х-,ного раствора ПЭГ. Эффективностыибридизации клеток оценивают на цитологических препаратах, орошенных гематоксилинэозином по количеству гомокарионов, Процент слившихся клеток,свободных от микоплазм, почти в 2раза для штамма СПЭВ"13-А 4-ТК и в1,5 раза для штамма СПЭВ-Д 5-ТКпревышает процент слившихся контаминированных клеток,Способ деконтаминации от микоплазм тимидинкиназодефектных клетокпозволяет быстро достичь положительного результата. Целесообразно с помощью этого способа деконтамннироватьклеточные линии с ТК - фенотипом иосуществлять криоконсервированиебольших количеств образцов, которыезатем при необходимости можно рекультивировать для проведения двух-трех,месячных экспериментов. Способ универсален для деконтаминации отмикоплазм ТК -линий клеток.