Способ определения изопероксидаз-антигенов

(57) Изобрехимическойхимии, моле ОПРЕДЕЛЕНИЯ ИЗОПЕРО иэикок био" биотехение относится логии, а именн кулярнои биолог 1 являют изоФормы перллюлоэной мемые являются ан- Фиай все имеющиес а на нитроц сидазь ишь те, кото и связывалис бранетигенамсорбиров антителами,роцеллюлоэной ными на и ембране ольз ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИПРИ ГКНТ СССР Изобретение относится к Физико-хи-мической биологииа именно к биохимии, молекулярной биологии и биотехнологии, и может быть использовано при изучении пероксидаз, а также для разработки экспресс-методов диагностики состояния растений, животных и человека.Целью изобретения является упрощение способа эа счет исключения стадии радиоиммунологицеского анализа,Цель достигается тем, что для выявления изопероксидаз-антигенов на полиакриламидный гель (можно исп овать и агарозный) накладывается и прижимается нитроцеллюлозная мембрана, на которой предварительно сорбированы антитела, После определенного вревремени их разделяют и обрабатывают (и гель, и мембрану) реактивами на пероксидаэную активность, На геле проа 9)Яппи 1 56971 1 ологии, и может быть использовано при изучении пероксидаэ, а также для разработки экспресс-методов диагностикисостояния растений, животных и человека, Целью изобретения является упрощение способа определения изопероксидаэ-антигенов, Изобретение состоит втом, что при определении изопероксидаз-антигенов перед переносом разделенного белка с геля на нитроцеллюлозную мембрану ее предварительно обрабатывают специФической антисыворот кой к антигену, а регистрацию антигена перенесенного на мембрану, огуществляют по пероксидаэной активноспособ осуществляется следую образом,Листья семидневных проростков кук рузы измельчают в трис-глициновом буФере рН 8,3, содержащем 30% саха- розы в соотношении растительный материал: буФер :5, После цс.триФугирования надосадочную жидкость диялиэуют против дистиллированной воды и осаждают белки ацетоном Полученный осадок белков растворяют и 30%-ном растворе сахароэы и используют для изоэлектроФокусирования 1 зоэлектроФокусирование (ИЭФ) проводят в 5%- ном полиакриламициом гс.пе, содержаЗаказ 1444 Тираж 509 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР113035, Москва, Ж, Раушская наб., д, 4/5 Производственно-иэдательский комбинат Патент", г.ужгород, ул. Гагарина,101 щем 2% амфолинов с интервалом рН 3,5- 10,0. Размер пластины геля 110 х х 100 х 1 мм, Режим ИЭФ 15 мин - 130 В;30 мин - 200 В 1 60 мин - 750 В.После окончания ИЭФ на пластину5 геля накладывают нитроцеллюлозную мембрану с размером пор 0,22 мкм с сорбированными антителами (мембрану предварительно инкубируют с антисывороткой при комнатной температуре при постоянном покачивании в течение одного час:), с :-.":,у мембраны накладывают 4-5 листов Фильтровальной бумаги, пропитанной 0,01 М Иа-фосфатным буфером рИ 7,2, содержащим 085%-ную МаС 1, накрывают стеклом и прижимают грузом массой 500 г.Процесс конъюгации антигенов с антителами идет один час при комнатной 20 темперагуре, Затем гель и нитроцеллю., лоэную мембрану разъединяют, гель и мембрану опускают в 0,02%-ный раствор солянокислого бензидина и выдерживают 30 и 5 мин соответственно, после че го гель и мембрану заливают раствором, перекиси водорода. После того, как появятс:." полосы белков обладающих пероксидазной активностью, сравнивают местонахождение их на нитроцеллюлоэной мембране и полиакриламидномгеле и идентифицируют изопероксидазантигены,Таким образом, упрощение предлагаемого способа достигается засчет сокращения количества операцийкроме того, для его реализации нетребуются меченые вторые антитела илибелок А,Способ определения иэопероксидаэантигенов, включающий электрофорети"ческое разделение изопероксидаэ в геле, перенос белка на нитроцеллюлознуюмембрану, определение пероксидаэнойактивности в геле и регистрацию антигенов с помощью антител на мембранео т л и ч а ю щ и й с я тем, что,с целью упрощения способа за счетисключения стадии радиоиммунологичес"кого анализа, перед переносом белканитроцеллюлозную мембрану предварительно обрабатывают специфической антисывороткой к антигену,а регистрацию антигена,. перенесенного на мембрануосуществляютпо пероксидаэной активности,