Способ количественного определения антител к коллагену

ОП ИСАНИЕИЗОБРЕТЕН ИЯК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ Союз СфветскикСфциалистичесникРеспублик(22)Заявлено 18.07. 80 (21) 2966206/30-15 с присоединением заявки РЙ С 01 й 33/56 6 01 М 33/80 Гееудлретеенай кемитет СССР ае делам взабретеннк и еткрытвй(72) Авторы изобретения В.М. Земсков, М.Д. Смирнов, А.Б. Алексеев Й В.П. Масенко Всесоюзный кардиологический научный центр АМИ -СССР.(54) СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИТЕЛ К КОЛЛАГЕНУ Изобретение относится к медицине, а именно иммунологии, и может быть использовано для анализа иммунологических препаратов. Известно определение количества антител (АТ) к коллагену радиоиммуно логическимметодом, заключающееся в том, что к исследуемому раствору добавляют меченный радиоактивным1 о изотопом коллаген и образовавшиеся в ходе иммунологической реакции нерастворимые комплексы антиген-анти- тело (АГ-АТ) отделяют соосаждением с помощью независимой дополнительт 5 ной системы АГ-АТ, которая образует обильный преципитат, После серии отмывок осадка определяют количество антител в исследуемом растворе по преципитировавшей радиоактивности с помощью калибровочной кривой 13Основным недостатком этого метода является методологическая сложность. Кроме того, процесс маркирования коллагена "связан с использованием большого количества изотопа.Цель изобретения - упрощение способа.Для достижения поставленной цели согласно способу определения антител к коллагену, включающему постановку серологической реакции с исследуемым раствором и последующее измерение преципитирующей радиоактивности, предварительно проводят адсорбцию коллагена на полихлорвиниловую поверхность в буферном растворе при рН 9,0-10,0 и температуре 30-37,5 оС в течение 2-6 ч, затем на полихлорвиниловую поверхность наносят исследуемый раствор и связавшиеся при этом антитела детектируют "вторыми" "1-антителами к иммуноглобулинам животного - продуцента .антител к коллагену.П р и м е р 1. Для адсорбции коллагена на полихлорвиниловую поверхность готовят раствор коллагена 1 ти 393579па быка в буферном растворе с рН 910. Раствор наносят на полихлорвиниловую поверхность, выполненную в виде лунки, и,выдерживают 2-6 ч при30-37,5 С. Избыток коллагена удаляют при промывке лунок. Исследуемыйраствор антител в буфере в различныхразведениях вносят в лунки, АТ проч.но связываются с адсорбированным наполихлорвиниле коллагеном, все ос- втальные компоненты исследуемого раствора удаляются при промывке.-" Оставшиеся в лунке не смытые иммуноглобулины (т.е, антитела) детектируются"вторыми" меченными 6 Эантителами к иммуноглобулинам животногопродуцента АТ к коллагену. Избыток"вторых" АТ удаляют промыванием, Ко"личество АТ к коллагену определяетсяпо калибровочной кривой, исходя из.количества радиоактивности, специфически связавшейся в лунке.На чертеже представлена калибровочная кривая,Построение калибровочной кривойотличается тем, что в качестве исследуемого берут препарат чистых антител к коллагену 1 типа известнойконцентрации.П р и м е р 2. А. Получение твердой фазы,В лунку из полихлорвинила вносят100 мл раствора коллагена 1 типабыка (17 мкг/мл) в 0,01 М карбонатномбуфере рН 9,6 и инкубируют 2 ч при37 оС и ночь при 4 С, Затем промываюто 3510 раз холодной водопроводной водой.В каждую лунку вносят по 200 мкл10-ной нормальной лошадиной сыворотки в фосфорном буФере рН 7,0+ 0024 Май+ 0 054 ТВИН), инкубируют 2 ч при комнатной температуре,5 раз промывают 1/-ной нормальнойлошадиной сывороткой.45Б.Определение количества антителк коллагену.В лунки из полихлорвинила с адсорбированным на них коллагеном 1 ти.па быка вносят по 100 мкл различныхразведений в Фосфатном буфере рН 70 висследуемых растворов, содержащих АТкролика к коллагену 1 типа быка. Инкубируют 3-4 ч при комнатной температуре, промывают проточной водой ивносят 50 мкл раствора "вторых", меченных 3 -антител барана к иммуноглобулинам кролика 50.000 имп/минна лунку в фосфатном буфере рН 7,0. 1 4Инкубируют ночь при 4 С, промывают проточной водой, вырезают лунки и просчитывают радиоактивность на гамма-счетчике. Количество АТ кролика к коллагену 1 типа быка в исследуемом растворе определяют по калибровочной кривой, исходя из связавшегося с лункой количества радиоактивности.Для определения уровня неспецифического связывания в каждом эксперименте в качестве одного из исследуемых растворов используют нормальную сыворотку кролика, инактивированную при 56 оС 30 мин. Для построения калибровочной кривой в качестве исследуемого раствора берут раствор чистых антител кролика известной концентрации к коллагену 1 типа быка.Для разведенного в 20, 200 и 10000 раз исследуемого образца получаем соответственно 19,250, 10290 и 600 имп/мин. Исходя из внесенного ко" личества радиоактивности 50000 имп/мин, вычисляют процент связывания радиоактивной метки с твердой фазой,равный 35;5; 20,6 и 1, 124 соответственно. Количество антител в исследуемом образце определяют по калибровочной кривой, исходя из процента связывания метки и учитывая разведения. Проценты связывания,.полученные для разведений .1;20 и 1:10000 лежат вне капибровочной кривой и поэтому непригодны для определения количества антител. Величина 2 С,6 лежит на рабочем участке калибровочной кривой и вполне пригодна для вычисления по ней количества антител. Исходя из этого и используя данные для разведения исследуемого раствора в 200 раз, получаем, что в 50 мкл этого раэведе. ния исследуемого раствора содержйтся 9,0 нг антител, а их концентрация составляет 36,0 мкг/мл. П р и м е р 3. Все условия осуществления способа по примеру 1, за исключением того, что в качестве исследуемого образца используют раствор антител к коллагену 1 типа быка с исходной концентрацией 1,1 мг/мл. Исходный раствор разводят в 4000 и 20000 раз. Процент связавшейся радио активности оказался равным 25,4 и 8,3 соответственно. Определенная по калибровочной кривой концентрация исходного раствора составляет 1,13 мг/мл и 1,04 мг/мл соответственно.791 6 ные для определения радиоактивности пробы могут храниться в любых . условиях, а при использовании пере" счета на распад изотопа - практичес ки неограниченно долго. Формула изобретения 5 935Иэ примеров видно, что предлагаемый способ позволяет получить резуль ., тат с точностью 44, что вполне удовлетворяет требованиям, предьявляе" мым к подобным способам в биохимии., Предлагаемый способ сравним по точности определения с известным жидко. фазным радиоиммунологическим способом определения количества антител к коллагену и в то же время является О значительно более простым.Предлагаемый способ определения АТ и коллагену 1. типа является высокочувствительным, точным, воспроиз- Водимым, высокоспецифичным, простыму 5 технически удобным, высокопроизводительным и не требует работы с большими количествами радиоактивности. Чувствительность метода 5-10 нг бел. ка антител в мл (0,25-0,5 нг АТ в щ 50 мкл пробы). Специфическое связывание "вторых" АТ составляет 30- 4 от вносимой дозы, а неспецифическое 0,9-4,5. Специфическое связывание подавляется в присутствии раство ю римого коллагена 1 типа быка.Предлагаемый способ позволяет де" тектировать АТ к коллагену 1 типа в любых Физиологических растворах. Использование малых доз радиоактивности делает его практически пол" ностью безопасным, не требуется также никакого вспомогательного сложного оборудования. Полностью подготовленСпособ количественного определения антител к коллагену, включающийпостановку серологической реакциис исследуемым раствором и последующее измерение преципитирующей радиоактивности, о т л и ч а ю щ и й с ятем, что, с целью упрощения способа,предварительно проводят адсорбциюколлаген на полихлорвиниловую поверхность в буферном растворе .прирН 9,0-10,0 и температуре 30-37,5 Св течение 2-6 ч, затем на полихлорвиниловую поверхность наносят исследуемый раствор и связавшиеся при этомантитела детектируют "вторыми"1 Ю 3 "антителами к иммуноглобулинамживотного - продуцента антител к коллагену,Источники информации,принятые во внимание при экспертизе1.Иепге,. Радоиепипоаээау тог апйсо 11 ацеп апйЬодез цэп 9 Р 4 С 3 .аЬе 11 ед со 11 ацеп. д. ваипо 1. ИейЬ.1977, 11, р. 77-Ч.каз 4198/44 Тираж 887 Подписное НИИП Фипиа ПП "Пате 935791 г, Ужгород, ул, Проектная, Ф