Способ определения состояния в-системы иммунитета

(51)4 С 01 И 33/5 01 И 33/5 ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИПРИ ГКНТ СССР ПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ Н А ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТ 1 2Изобретение относится к медицине, тоду, принятому в лаборатории, напри- а именно к иммунологии, и предназна- . мер замораживанием - оттаиванием, чено для выявления активации В-систе- Для разделения изоэнэимов лактатдегид мы иммунитета, рогеназы (ЛДГ) в В-клетках используютЦель изобретения - повышение точ- метод энзимов электрофореза в поли- ности способа определения состояния акриламидном геле. Активность изоэн" В-системы иммунитета. зимов ЛДГ оценивают денситометрическиСпособ осуществляют следующим об- После чего высчитывают коэффициент разом. соотношения величин активностиЛимфоциты периферической крови ЛДГ: ЛДГ(К,) путем деления величивыделяют в градиенте плотности Фиколл- ны активности ЛДГ, на величину активверографина, Общую популяцию лимфо- ности ЛДГ.цитов разделяют на Т- и В-фракции Пример. Д любым из принятых в лаборатории мето- зирован к резус-ан дов розеткообразования или сепарацией антител 1:512, И на нейлоновой вате, Полученные В-клет мл крови на консерванте. кй доводят изотоническим раствором Кровь осторожно наслаивают на хлористого натрия до концентрации графин и центрифуги 10 в 1 мл, Клетки разрушают по ме об/мин. Образоонор А, проиммунитигену, титр резуслоктевой вены взято 3 смесь Фиколл-веро руют 30 мин при 1(71) Белорусский научно-исследовательский институт переливания крови иМинский государственный медицинскийинститут(57) Изобретение относится к иммунологическим методам исследования иможет быть использовано для выявленияактивации В-системы иммунитета, Цельизобретения - повышение точности способа, Для оценки состояния В-системыиммунитета определяют изоэнзимнийспектр лактатдегидрогеназы (ЛДГ) вВ-лимфоцитах периферической крови ипо коэффициенту соотношения величинактивности ЛДГ,: ЛДГ (К ) судят осостоянии В-системы, Значение коэФФициента выше 1,45 свидетельствуетоб активации В-системы иммунитета,Положительный эФФект предлагаемогоспособа заключается в его большейточности по сравнению с известным,используя который, не всегда удаетсявыявить активацию В-системы, т.к,противоположная направленность изменений активности иэоэнзимов можетне привести к изменениям общей активности лактатдегидрогенаэы.15 ЛДГ остается без изменений,Формула изобретения 30 Составитель М,ГубаревТехред И, Верес. Корректор Л, Пилипенко Редактор Н. Тупица Заказ 1192/43 Тираж 788 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раущская наб., д. 4/5Производственно-издательский комбинат "Патент", г.Ужгород, ул. Гагарина, 101 3 14675 вавшееся кольцо лимФоцитов осторожно собирают пипеткой в центриФужную пробирку и отмывают дважды раствором Хэнкса по 10 мин при 1500 об/мин. Осадок лимФоцитов ресуспендируют в среде 199, содержащей 5% инактивированной телячьей сыворотки, доводя концентрацию лимФоцитов до 8 - 10 10 в 1 мл. Количество лимФоцитов 10 определяют путем подсчета под микроскопом в камере Горяева. Разделение лимФоцитов на Т- и В-популяцию проводят на колонках с нейлоновой ватой, В-лимФоциты разрушают путем 10"крат 15 ного замораживания (-20 С) и оттаивания (18-20 С).ЭлектроФорез изоФерментов ЛДГ в полиакриламидном геле проводят на аппарате для вертикального гель-элек троФореза. Исследуемую взвесь разрушенных ли.фФоцитов в количестве 0,1 мл наносят в трубочки, заполненные гелем. Сверху осторожно наслаивают трис-буФер, трубочки закрепляют в катодной камере аппарата. В катодную и анодную камеры заливают по 1 л трис-буФера (рН 8,3). Продолжительность электроФореэа 2 ч в холо- . дильнике (4-8 С). Извлечение геля проводят,в кювете с водой под давлением из шприца, Гель промывают водой, помещают в пробирки и запивают краской, прогретой до 37 ОС.Состав краски: Ь - лактат (288 мг 35 в 3 мл НО), НАЛ (45 г в 1,5 мл НО), НаС 1 (0,1 М - 3 мл), МяС 1 (0,1 М - 3 мл), ФосФатный буФер (рН 7,4-7,5), нитротетразолевый синий (15 мг в 4 мл НО) и непосредственно. перед заливкой 40 добавляют ФМС (Феназинметасульфат) (1%-ныл раствор - 0,75 мп). Пробирки ставят в термостат и выдерживают для развития окраски в течение 1 ч при 37 С. После акрашивания изоферментных Фракций гель промывают водой и заливают 7%-ным раствором уксусной кислоты, Активность иэоФерментных Фракций определяют денситометрически. У донора А, величина активности ЛДГ, 30,85%, ЛДГ12,77%, ЛДГЗ 46,81%, ЛДГ 5,3%, ЛДГ4,26%, Высчитывают коэФФициент соотношения ЛДГ: ЛДГ, который составил 7,24, У здоровых лиц К равен 1,01+0,44, Следовательно, согласно предлагаемому способу у донора выявлена активация В-системы иммунитета.Положительный эФФект предлагаемо." го способа состоит в обеспечении большей точности в выявлении активации В-системы иммунитета по сравнению с известным, поскольку увеличение активности одной из Фракций изоФермента свидетельствует об активации В-системы иммунитета, хотя общая активность Способ определения состояния В-системы иммунитета путем выявления активности лактатдегидрогеназы В-лимФоцитов, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения точности способа, с помощью электрофореза выявляют активность изоФерментов лактатдегидрогеназы ЛЛГ ЛЛГ, ЛЛГз, ЛЛГ и ЛДГ, далее устанавливают соотношение между показателями, максимально различающимися по электроФоретический подвижности, и при значении коэФфи-; циента 1,45 и вьппе определяют активированное состояние В-системы иммунитета.