Способ определения активности пероксидазы

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОРИА ЛИСТИЧЕСНИХРЕСПУБЛИК 1262350 Е 14 С 01 ПИСАНИЕ НИ.8)Попова И.М., Долева Г.Н. Биохимия,2, с. 2243-2253. ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРГ 10 ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ ТОРСНОМУ СВИДЕТЕЛЬСТ(21) 3827799/28-14 (22) 17.12,84 (46) 07.10.86. Бюл (71) Научно;-иссле ститут биологии пр сударственном унив им. А,А.Жданова (72) М.Н.Саксонов, Т.В.Забелина и Д.И (53) 612.015.01(08 (56) Угарова Н.Н., манова И.Ф Шехов 1980, т. 45, вып.(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИПЕРОКСИДАЗЫ(57) Изобретение относится к биохимии. Цель изобретения - повышение .чувствительности споооба за счетиспользования в качестве субстратасмеси пирокатехина и резорцина. Вкювету снектрофотометра вносят фосфатный буфер, раствор пирокатехина,резорцина и пероксидазы. Реакцию иницируют добавлением О,ОЗЖ-ного раствора перекиси водорода. После перемешивания реагентов определяют увиличение оптической плотности. Затемопределяют активность фермента.1262350 30 40 ВНИИПИ Заказ 5418/39 Тираж 778 Подписное Произв-полигр. пр-тие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 Изобретение относится к биохимии,а именно к способам определения ак-,тивности пероксидазы, и может бытьиспользовано в биологии, токсикологии, медицине. 5Цель изобретения - повышение чувствительности способа за счет использования в качестве субстрата смеси пирокатехина и резорцина,Сгособ осуществляется следующим0образом.В кювету спектрофотометра последовательно вносят 1 мл 0,07 М фосфатного буфера рН 7,3 80мл Ор 040,07 М раствора пирокатехина; 1 мл150,02-0,03 М раствора резорцина;0,5 мл раствора, содержащего пероксидазу. Реакцию инициируют добавлением0,5 мл 0,03%-ного раствора перекисиводорода. После быстрого перемешивания реагентов определяют увеличение оптической плотности при 460 нм.Активность фермента в условньх едиЭницах А = , где Э - оптичес 7 Ская плотность 1 - время, мин,оптическая толщина кюветы, см; С -концентрация фермента, мг/мл.П р и м е р 1, Определяют активность пероксидазы фиры "Реанал". Вкювету вносят 1 мл фосфатного буферарН 7,5; 1 мл 50 мМ пирокатехина,мл 25 мМ резорцина: 0,5 мл пероксидазы ( 2 мкг/мл в фосфатном буфере); 0,5 мл 0,03%-ного раствора перекиси водорода и измеряют оптичес"кую плотность при 460 нм,ЬЭ = 0,62; Г = 1 см;= 1 минС = 0,25 10 мг/мл, А =- 6 ПЙ 7 С == 2480 усл.ед.П р и м е р 2. Измерение проводятаналогично примеру 1, за исключениемтого, что рН = 7,25, концентрацияпирокатехина 40 мМ, резорцина 20 мМ. 0 = 0,57; С = 1 мин,", 1 = 1 см; С = 0,25 10 мг/мл; А =- О/ 1 С =- 2280 усл.ед.П р и м е р 3. Измерение проводятаналогично примеру 2, за исключением того, что рН = 8,00, концентрация пирокатехина 70 мМ, резорцина30 мМ,Ы) = 0,55; т = 1 мин; 0 = 1 см;С = 0,25 10 мг/мл; А = Ь П/1 С2200 усл,ед.П р и м е р 4. Определение активности пероксидазы в злодее канадской.Навеску элодеи 500 мг сырого веса растирают в фосфатном буфере0,01 М, рН 7,50, переносят в мернуюколбу на 25 мл и доводят до меткицентрифугируют в течение 10 мин при3000 об/мин, Измерения проводят согласно примеру 1, но вместо 0,5 млраствора пероксидазы в кювету помещают 0,5 мл вытяжки, Во втором варианте навеску элодеи предварительноинкубируют в течение 30 мин в растворе ингибитора пероксидазы - 1 О Мсульфида натрия, затем злодею отмывают и определяют активность ферментааналогично указанному. Расчет проводят на 1 г/мл сырого веса элодеи.Активность пероксидазы нативнойзлодеи,ЬП,= 0,52 + 0,06;= 1 мин;- 1 см; С = вес/объем = 0,5:8:250,0025 г/мл (С - концентрация рас.тительного материала в кювете).А = дР/ 7 С = 208 усл.ед,Активность пероксидазы злодеи после обработки ингибитором.Бг = 0290,04; с = 1 мин;1 см; С = 0,025 г/мл; А == Ь)Й УС = 116 усл,ед. Формула изобретения Способ определения активности пероксидазы путем инкубации пробы, со- держащей пероксидазу, перекись водорода и окисляемый субстрат, с последующим измерением оптической плотности смеси, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью повышения чувствительности способа, в качестве окисляемого субстрата используют смесь, содержащую 40-70 мМ пирокатехин и 20-30 мМ резорцин, а определение ведут при рН 7,25-8,00.