Способ получения аттенуированного штамма вируса

Сфез Сфеетсим Сфциапистнеккреспублик 069 Дополнительный к пате(22) Заявлено 2004.77(21) (23) Приоритет - (32) (3) 672-840 (33) 2 К 5/00 2 К 7/00 омит рственныСССР елам и н откР зобретенийытий 616,988 (088.8) публиковано 25.11.7 ата ликования(72) Автор изобретению ИностранецЧарльз Уильям Пер1) Заяви ПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АТТЕНУИРОВАННОГО ЮТ ВИРУСА ЕСИПЕ т ПтПОРПЕОтОП 1 МЗ сбоИзобретение относится к способуполучения вируса для защиты лошадей от конской ринопневмонии,Ринопневмония представляет собойострую вирусную инфекцию, которая,капредполагается, вызывается вирусом Есо 1 ие Нелрез тип 1, и отличается лихорадкой, агрунлоцитозом икатаральным воспалением органовдыхания. Вирусная болезнь предрасполагает ко вторичной бактериальнойинфекции, которая воздействует наразличные части органов дыхания,При заражении жеребой кобылы, какправило, происходит аборт.Ринопневмония обычно наблюдается на фермах, расположенных в районах, где сконцентрировано коневодство. Относительно равномерная картина наблюдается в центральномКентуки, где изучались болезни органов дыхания и причины абортов.Заболевания органов дыхания наблюдались исключительно у молодых лошадей, либо на Фермах, либо когдалошадей собирали для тренировки,В этом районе на большинстве фермбыли отмечены вспышки ринопневмониив конце или в начале. зимы, особенно в октябре, ноябре и декабре. У молодых лошадей вспышки болезни часто были связаны с отъемом и ром в зимних помещениях. В это время кобылы не имели очевидных признаков болезни, но инфекцию можно было обнаружить с помощью серо- логической реакции. Болезнь быстро распространяется в конюшне или районе тренировки и через несколько дней или недель все лошади в этой зоне заражаются.Аборты наблюдаются в каждом месяце, кроме июля и августа, Наибольшее число абортов приходится на середину зимы и раннюю весну, Из 700 абортов, зарегистрированных в Кентуки, 15 Р произошло в январе, 24 Р - в феврале , 29 Р в марте и 18 р - в апреле. Аборт может произой ти начиная с 5-го месяца беременности до окончания срока беременности. Некоторые жеребята, зараженные внутриутробно, остаются живыми до конца беременности. Данные по 623 абортам показывают, что 11 Р абортов произошло на 8-ом месяце, ЗОР - на 9-ом месяце, 36 Р - на 10-ом месяце и 19 Р - на 11-ом месяце. Эти данные показывают зависимость между возрастом зародыша и временемн Х н о н в.й ан ФМФ2 МЗЖВов ф СЧ р о Х 1 а е хооан одооо ЙОВЗР 3 3 Ч ф Р л 3 Ч Л ф Р 3 ф 3 л сЧ сЧ л ао700069 Т а б л и ц а 4Результаты исследований по выделению вируса у новорожденных жеребят в е 1024 2 73 16 3 б 3 4 евиваемой линии клетокзеленой мартьпаки) в теассажей при температуре ники информациинимание при экспертСИЛ Р 3725542,973ь 5 Сос авитель А МакаровТехРед Н,Вабурка КоРРе актор Д.Пинчук Н.Эадерновска аэ,726 Тираж 526ЦИНИПИ Государстве по делам иэобретени 13035 Москва, ж, Ра ПП Патент, г.ужгород, ул,Проект или ФооСпособ штамма ви путем осл при культ о т л и ч с целью с тивндсти мула и получ уса Е блени виров ающ охране его, вэобретения ения аттенуирова о 1 пе Ь 1 портеотоп я его вирулентн анин в культуре и й с я тем, ния иммуногенно ирус ослабляют нного Иэ стиклеток,что,тивируя в перВеро (печеньчечне 30-60 и23-33 С,Источпринятые во вПатенткл. 424-89, 1 Подписноеого комитета СССРи открытийская наб., д 4/55 10 15 20 25 30 35 40 50 60 аборта, но период осеменения кобыли Энэоотическая картина у молодыхлошадей имеют значительное влияниена сезонное число заболеваний ивозраст зародыша во время аборта,Период инкубации между носовойинокуляцией и абортом составляетот трех недель до четырех месяцев,что указывает на то, что инфекция,которая приводит к аборту, совпадает с более ранним энзоотическим заражением молодых лошадей на фермах.Вирус легко распространяется принепосредственном контакте черезразличные посторонние предметы ичерез аэролизованные выделения.Вирус может передаваться от однойкобылы, у которой был аборт, к другой кобыле, но в большинстве эпидемий (как показывают данные) дополного аборта в течение 1 - 4 месяцев заражаются почти все кобылы,Болезнь случается ежегодно умолодых лошадей на многих Фермах,на которых не было новых лошадей,что позволяет сделать предположениеУо наличии переносчиков среди взросль 1 х лошадей. Регулярность вспышекпри сборе восприимчивых молодыхлОшадей также свидетельствует оналичии носителя, Вспышки частопроисходят тогда, когда восприимчивые лошади собираются для продажи во дворах, на тренировочныхплощадках скачках и в военныхорганизациях.Инкубационный период ЕКР длитсяот 2 до 10 суток. Первичная инфекция полностью восприимчивых лошадей проявляется в виде лихорадкии сильного выделения из ноздрей.Температура может составить 41 ф Си лихорадка в несложных случаяхпродолжается от 1 до 7 суток. Температура после полудня, как правило, выше, чем утром. Агранулоцитозпроисходит параллельно с лихорадкой,В течение первых двух суток лихорадки нейтрофилы и лейкоциты угнетаются. Лимфоциты возвращаются кнормальному уровню через 2-4 суток,а нейтрофилы - через 5"9 суток.Потребление кормов и воды падает.Наблюдается средняя гиперемия носовой слизистой оболочки и прощупывается Ьтек нижнечелюстных лимфатических узлов. В несложных случаяхчастб наблюдаются энтерит и диарея,отек ног и тендовагинит. Общаядепрессия у лошадей, которые содержатся в покое, незначительная.Все признаки обостряются при выполнении упражнений или при работе,Полное выздоровление наступает через 1-2 недели, если не развивают"ся осложнения,Повторное заражение происходитчерез 4-5 месяцев и более. Это последующее заражение, как правьло, бессимптомно, безлихорадочнои не дает осложнений, в частности,у взрослых лошадей на племенныхфермах. Влияние повторного заражения на лошадей, участвующих в скачках или занятых на тяжелой работе,неизвестно.Известен способ получения аттенуированного штамма вируса Есо 1 пеВ 1 порпецвоп 1 Са при проведении 3-10пассажей в культуре клеток печенимартышки, а затем в первичных культурах клеток, полученных от овец,свиней, поросят и в перевиваемыхлиниях клеток, выделенных из первичных культур клеток 1,Недостатком известного способаявляется потеря иммуногенности вирусом.Целью изобретения является сохранение иммуногенной активности вируса.Это достигается тем, что вирускультивируют в перевиваемой линииклеток Веро (печень зеленой мартышки) в течение 30-60 пассажей при23-33 С.Модификация или ослабление морфологии или патогенности вируса осуществляется многочисленными способами. Иногда неоднократный серийныхперенос в ткань хозяина ослабляеторганизм, серийный перенос в ткань,которая отличается от ткани хозяина, иногда приводит к ослаблению;химический шок организма, облучение, низкотемпературный перенос ицругие способы широко испольэуют"я бактериологами и вирусологамицля получения патогенно инертныхорганизмов, который сохраняет своюспособность заставлять своего хозяина образовывать антитела или клеточный промежуточный иммунитет, способный эффективно нейтрализовать болвзнетворный организм. Ослаблениебеэ потери иммуногенности живого организма совершенно непредсказуемо идейственность любого способа определяется только опытным путем.Например, способ, пригодный дляодного типа вируса, может оказаться непригодным для другого типа.В известном способе ослаблениявирулентного штамма ЕкР производитсяпутем выращивания и размножения ринопневмонических вирусов, выделенных иэ плода зараженных лошадей,зараженных жеребят и выкидышей в;чувствительной ткани, полученной изчувствительных органов (например,печень мартышки), восприимчивыхопытных животных и восприимчивыхперввиваемых линий клеток, пригодных для выращивания и размноженияукаэанных вирусов, при этом размножение включает от трех до десятипереносов, полное ослабление вирусов до тех пор, пока они не потеряют патогенность для лошади путемсврийного переноса через первичныекультуры клеток, полученных от овец,свиней и поросят и из постоянныхстабильных линий клеток, выделенныхиэ первичных культур клеток.Предполагается, что иммуногенная защита от повторного заражениявирулентным вирусом ЕЦР не происходит, если авирулентный вирус невоспроизведет себя в животном-хозяине. Авирулентный вирус можетбыть извлечен и опознан после вакцинации,Установлено, что если стабильнуюлинию клеток из Африканской зеленоймартышки Сепосор 1 Юесоэ ае 1 Ыорз, линияклеток Веро, инокулировать вирулентным вирусом КРВ и серийно переноситьв такой линии клеток при пониженнойтемпературе, например 23-33 С, вирус становится ослабленным и невирулентным, но в то же время остается иммуногенным, т.е. при введении в лошадь-хозяина он приведетв действие свой иммунологическиймеханизм для производства вирусныхантител и получения клеточногопромежуточного иммунитета. Послеэтого животное становится стойкимк последующей инфекции и иэ вакцинированного животного может бытьполучен вирулентный вирус, которыйопознается.При использовании обычных методов серийного переноса, которыеявляются стандартными в данной области, было установлено, что необходимый авирулентный характер развивается беэ потери иммуногенностипосле примерно 30 - 60 переносовпри температуре в диапазоне примерно 23 - 33 ОС. Однако может бытьиспользовано примерно 250 - 300 переносов и более.Вакцина КЙР может назначатьсялюбому виду иэ семьи либо внепарентерально, либо внутрипарентерально.Вакцина в жидком виде может вводиться в ноздри, внутриглазно, внутримышечно, внутривенно, внутрибрюшинно и т.д. В виде сухого порошкавакцина может назначаться внепарентврально. Как правило, вакцины такого типа в количестве 3000 - 100000единиц ТС 106 назначаются в однойдозе,Воспроизведение вируса.Тканевые культуры клеток готовятс использованием стабильной линииклетоК Веро, полученной из Африканской зеленой мартышки при количествепврвносов 129, Стандартный стеклянный сосуд для культуры эасвиваюттрипсинизированной суспензией клеток Веро, содержащей достаточное количество среды для акрытня клеток на глубину 13 мм. Используется,среда адСЕз Юппоа,п Ез:еп;чае лей 01 п(РЕИ, которая содержит 10 сыворотку эмбрионального теленка лаяпитательной среды (5 Ь в под.держивающей среде). Однако может быть использована любая пита"тельная среда, например, Лактальбуминая гидролизатная среда в сбалансированном соляном растворе ланкса,Среда 199 и т.д. Сосуды с культУрой инкубируют при 37 ОС в течение1"3 суток, после чего образуетсямонослой клеток Веро.Затем сосуд заражают Емпе Непрев1, (культура А 183, полученная из калифорнийского университета) с использованием стандартных асептических способов и после 24-72 час инкубации при 37 ОС цитопатология клетокпоказывает, что вирус воспроизвелсебя. Число переносов вируса в клетки Беро при 37 С составляет 13 раз,как н ранее. Затем вирус подвергается ослаблению,Ослабление.Используя стандартные колбы скультурой клеток ткани и питательной средой, указанной выше, готовятмонослой клеток Веро. Примерно 10030 ТС 105 о/мл вируса .13-го переноса вво.дят в колбы и инокулированные колбыинкубируют при 26 С. Через 8- 10 суток отмечают небольшие зоны перерождения клеток, и второй серийный35 перенос делают с некоторым количеством жидкой среды. Инкубация при 26 Спродолжается и клеточная цитопатоло"гия увеличивается. После каждогосерийного переноса цитопатология4 О ввозрастает и после примерно 30-60серийных переносов устанавливают,что цитопатология завершается через 3-5 суток инкубации при 26 С,Этот ослабленный вирус обозначенкак вакцина А 283 У 26 Р 50 ЕКР.Последующие эксперименты в организме проводят с 50-ым или 55-ымпереносом холодного адаптированного вируса. Все кОличество вирусавакцины ЕЙР вводят глубоко внутримышечно.Заражение вирулентным ЕЙР производят путем серийного переноса неослабленного вируса А 183 в носовыевыделения и во всю кровь через четырех лошадей, Перенесенный конскийвирус вызывает классические симптомы ринопневмонии, а также абортыбеременных животных. Пул, зараженный вирусами ЕРР, используется не 60 однократно для заражения экспериментальных лошадей с отличнымирезультатами и неиммунных животных.Все вирусы вводят в ноздри,Для определения всех серологи 65 ческих реакций на вакцину ЕВРили заражение вирусом используютсерологическую реакцию нейтрализации,Чистота вируса вакцины ЕРР, полученного укаэанным способом, определяется путем нейтрализации цитопатогенного действия получаемого в культуре ткани с помощью изнестной сыворотки типа Ес),ивов Нагрев 1.Вирус вакцины дает большое колиЧество синцития в клетках РКэ и 1клетках Веро при 37 С. Синцитий, может быть использован в. качестне маркера для вируса вакцины, так как вирулентный вирус ЕРР производит индиВидуальное цитопатологическое дейст 1вие округляющего типа на клетку вукаэанной линии клеток при 37 С,Вирус вакцины убивает новорожденных хомяков и вирус выделяется кэметровых хомяков для получения маркера того же типа для синцития, Клинические симптомы конских вирусныхболезней не наблюдаются в вакцикированных лошадях илк жеребятах вразличных возрастных группах.Вирус вакцины может быть ныделэниэ конских периферийных лейкоцитовчерез 2-11 суток после вакцинацииЕйР. Другие вирусные агенты не выделяются после вакцинации, за исключением местной группы Негреэ(11 вкРУсов). Кроме этого, вирус вакцины,полученной из лошадей, содержит вакцинный маркер (синцитий).Экспериментальный нирус вакцины1183 У 2 б Р 50 проверялся на следующиевирусные агенты с помощью известныхспособов и ни один иэ агентов ке былобнаружен ЕсоЬе ЬгГесОооэ Апютпд чгвэбс)сгибе Негреэ Й ч 1 гоь,Ес)ипе аде",по г)гиз,Есоюе ЕосерЬсботпзеРЖсх чагин, Ес)ОЬе 1ЗпЮоепто (,К 1 ЕсЫ 11, А 1 ЕсЫ 21.Приготойление вакцины.Ослабленный вирус, приготовленный описанным виде способом, выращивают в больших количествах с использованием той же питательнойсреды, которую применяют в стандартных колбах для получения монослояФклеток Веро, Колбы инкубируют до завершения цитопатологии, как правило,в течение 3"4 суток, Затем питатель -ную среду собирают и перемешиваютсо стабилизирующим раствором и разделяют на дозы примерно 1000-10000000единиц ТС 10 в обычные ампУлы длявакцины. Затем материал подвергался замораживанию, высушиванию вампулах и эапечатывался.П р и м е р 1, Проверка сохранности вакцины ЕЧР и передачи вируса вакцины контактным лошадям. Кроме этого, проверяют действие вакциныв организме по сравнению с неослабленным вирусом.Группу иэ шести разных племенныхлошадей обоих полов содержат в групповом загоне, В пищу добавляют травяное сено и ячмень, устанавливают автопоилки. Группа получает ослабленную вакцину ЕРР, которую вводят всем глубоко внутримышечно. После первой через 28 дней делают аналогичную вакцинацию. Через 56 дней после первой вакцинации все лошади были заражены вирулентным вирусом ЕЙР. Определяют следующие параметры: всех лошадей ежедневно проверяют на клкнкческие признаки Е)(Р, измеряют температуру к проверяют серологическую реакцию, Три лошади выбирают для выделения вируса иэ ,носовых тампонов и клеток кожи.Выделение вируса началось на двухконтактных точках в момент заражения, Полный подсчет кровяных тепец проводят на лошадях, предназначенных для выделения вируса(см.табл,1,.),Выделение вирусов и идентификациюосуществляют на лошадях, у которыхнаблюдались выделения иэ носовых раковин, Принципалам присваивают номера; 104, /7, 52, 53 к 54, а контактномч контрольному экземпляру - ноглер 79. Результаты экспериментовпривецечы н табл,2,Данные таблиц свидетельствуют отом, чтсвакцина не вызывает симптомовболезни после любой вакцинации;ВиРус вакцины не передается кон:.акткым котрольным животным в течение более 5 б суток пребываниявместе перец заражением, Во времяэксперимента прокзводят многочисленные выделения вируса 11 Еаолб НЕгрЫХотя контроль (К 79) дает нормальные клинические симпто 1 ы конской рикопневмонии т,е. воспаление дыхательных ор 1.анон,та к недомогание, повышение температуры на несколько градусов выше нормальной н течение двух дней послезаражения вируленткым вирусом исильное понижение счета белых кровяных телец, вакцинированные принципапы были защищены от вирулентного вируса- отсутствие симптомов,нормальная температура тела и нормальтай счет белых кровяных телец,П р и м е р 2. Определение сохранностк ослабленной вакцины ЕЙР у жеребых кобыл (отсутствие клинических симптомов или абортов), а также определение действенности вакцины у беременных животных против вирулентного вируса ЕЙР с целью получе.нкя информации по пассивному антителу ЕЯР, переданному жеребятам безопасности вакцины на Различных стадиях беременности и определение передачи нируса вакцины контактным контрольным животным, которыми были ненакцинированные беременные животные, Опыт проводят на жеребых кобылах че 700069 10. тырех групп (см, табл. 3) . Жеребых кобыл пятой группы используют в ка -честве контрольной, Две группы вакцинируют сразу, их заражают в нос вирулентным вирусом ЕЯР спустя 40дней. Одна из этих групп получает 5холодный адаптированный вирус накцины 50-го переноса, Оставшиесядве группы жеребых кобыл вакцинируют днажды через промежуток в 20дней указанным выше образом холод.ным адаптированным вирусом тогоже уровня переноса. Две последниегруппы заражают в нос через 50дней после первой вакцинации.Исследуют следующие параметры:температуру, выделение вируса иидентификацию, цитопатогенное воздействие, титры нейтрализации сыворотки и клинические симптомы,Эти параметры определяли у кобыли жеребят, Жеребят исследуют на вирус из лейкоцитов крови и носовыхраковин непосредственно сразу после обнаружения и через два или тридня после рождения, Кроме этого,собирают сыворотку в момент выжеребки новорожденного жеребенка и черезнеделю после этого. В некоторых случаях на молочную железу надеваютчехлы иэ холста для предотвращенияподсоса после родов для получения ЗОнескольких образцов предмолозивнойсыворотки. Молозиво ЕРР, нейтрализующее антитело, замеряют у некоторых кобыл, Парные образцы сыворотки собирают у некоторых жеребчиков 35и кобыл в момент рождения и после.П р и м е р 3. Получение данныхо сохранности вакцины н жеребятах(определяется по томам и исследованиям клинической патологии) . Опреде Оление времени вакцинации жеребцов приналичии материнского антитела: выделению типа вируса у двухнедельноговакцинатного жеребенка и действенность пассивного антитела ЕЙР (табл,4)4.По группам 1-4 определяют следующиепараметры: температуру тела, цитопатогенное действие, выделение вирусаиз носовых раковин и лейкоцитов крови,нейтралиэующие серологии ЕкР и ежедневное наблюдение эа клиническимипризнаками болезни;Группа 1. Реакция жеребчика навакцинацию ЕЯР.Эта группа из восьми жеребчиковполучена от кобыл хорошо продокументированной родословной относительно их статуса ЕЯР. Вакцину вводят жеребцам внутримышечно в количестве одной сублимированной 1 млдозы вакцины й 183-У 26-ЕЙР содержащей 60106. 8 логов вируса/2 мл, которыйвосстанавливает 2 мл стерильной водыперед использованием,Группа 2, Реакция жеребчика навакцинацию ЕЯР 65 Жеребчик М Ь без матери. Историяматери по ЕкР неизвестна.Жеребчик Р 74 от зараженной контрольной кобылы, которая родила жеребенка через пять дней после заражения рулентным вирусом ЕРР, черезносовую раковину. Этот вирус выделен у кобылы, однако у жеребенкапосле родов выделен не был. Следовательно, увеличение не наблюдаетсяв молозивном антителе ЕЯР эа короткий период времени до рождения после заражения.Группа 3. Жеребчики, зараженныевирулентным нирусом ЕкР.Эта группа состоит из четырехжеребцов, которых заражают черезносовые раковины с помощью катетера с 10 мл вируса, содержащего20логов вируса/2 мл. История ко"былы ЕРР хорошо документирована,Группа 4, Состоит из двух жеребчиков от матерей с неизвестнымиисториями по ЕВР. Жеребчиков заражают аналогичным образом, так жекак и в группе 3.Ни один иэ вакциниронанных жеребцов не показал серьезных клинических симптомов. Иногда выделялисьб ак терии 51 гер 1 ососсц э ансер йЕ 1 псцэиз носовых каналов во время нечастыхвыделений иэ носовых раковин, которые не имели отношения к ЕЙР,Ни один иэ четырех зараженных жеребцов (группа 3), содержащих молозивное антитело ЕВР, не был боленили подавлен, как зараженные жеребцы, у которых не хватало молоэивного антитела ЕЯРТаким образом, нормальная температура тела жеребцдв выше чем увзрослых. Кроме этого, стресс отвоздействия окружающей среды, например, тренировка жеребцон илилежание на солнце, по"видимому, оказывают большее влияние на колебаниятемпературы, Тенденция к лейкопения чаще проявляется у вакцннированных жеребцов в период между 3-7 днями. Лейкопения проявляется сильнееу зараженных контрольных жеребцов.После заражения сильная лихорадочная реакция наблюдается у зараженных жеребцов без пассивного антитела в период между 2-6 днями.Очевидно,нет постоянного понышениятемпературы после вакцины ЕЯРили заражения ЕкР высокими уровнями пассивных антител Е%Р. Одинжеребец 155, показавший самое низ.кое нейтрализующее антитело ЕЯР,имеет такое же повышение температуры, как и контрольные зараженныежеребчики, однако, не была замечена депрессия или анорексия.Из полученных экспериментальныхданных можно сделать следующие выводы, 700069 12Приспособленный к холоду (26 С)вирус клетки Веро воспроизводитсяв организме при внутримышечном введении, образуя защитный иммунитет .от вирулентного вируса Е%Р, введенного в носовую раковину.Вирус вакцины не является патогенным при введении жеребым кобылам и жеребятам иэ различных иммунологических сред ЕЙР,Вирус вакцины может быть выделениэ лошадей, которые до этого былиподвержены ЕКР (измерение проводилось с помощью нейтралиэующегоантитела ЕкР) или от животных, неимеющих нейтрализующего антитела.Иногда вирус может быть выделениз промытых лейкоцитов крови илиредко из носовых раковин,Вирус вакцины ЕЯР не передаетсяконтактным контрольным лошадям приотсутствии сероконверсии контактных контрольных животных или привыделении негативного вируса иэконтрольных животных,Нейтралиэующие серологии из вакцинированных животных успешно сравнивают с серологиями, вызваннымивирулентным вирусом ЕВР, которыйиспользуется для заражения.Молоэивное антитело ЕЯР с высоким титром пассивно переходившеек жеребцам, по-видимому, защищает(отсутствие видимых симптомов) жеребцов От вирулентного вируса ЕКР,Клеточный промежуточный иммунитет, играет важную роль в защителошадей от абортов ЕЙР и клинических симптомов ЕНР, однако, до сих.пор не представляется возможнымизмерить клеточный иммунитет ЕЙРэто делается только путем заражения.Число выделений вируса, сделанных после вакцинаций с помощью воспроизведенной вакцины ЕКР или воздействия вирулентным вирусом .ЕкРво многом зависит от типа и степенииммунитета, которым обладает хозяинПредпочтительно выделять вирусы иэжеребцов с высокими уровнями молоэивного нейтрализующего антителаЕЙР. Ститается, что эти жеребцыимеют гуморальный иммунитет, который в зависимости от силы представляет улучшенную симптоматологию призаражении вирулентным вирусом. Однако гуМоральный иммунитет играет незначительную роль в изоляции состояния носителя вируса. В противоположность этому активный иммунитет,вызываемый вирусной инФекцией образует клеточный промежуточный и гуморальный иммунитет. Отсюда послеповторного воздействия воспроизведенным вирусом вакцины или вирулентным вирусом состояние переносчикавируса практически устраняется. Ио Наблюдаются три явных клинических случая мыта и были выделеныВЪгер 1 ососсцэ юоер 1 беттйоив, 51 ер. есастреп-группа.Вторн.аогеоэ и уодного жеребенка был обнаруженБСерЫсоссоэ есо . Эти бактерии периодически выделяли у испытываемых животных. Все бактерии могут давать 55клиническче симптомы лихорадки иливыделений иэ носовой раковины илито и другое вместе, поэтому их наличие часто исследуют для определения причины любого клиническогоотклонения, которое могло повлиять 60 на результаты исследований опытныхживотных. В большинстве случаевбактериальные вспышки были довольноясны, когда температура лошади иобщие карты лейкоцитов просматри 65 вались. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 видимому, существуют животные, невосприимчивые к ЕКР, у которых наблюдается такое состояние, и животные, перенесшие до этого ЕКР у которых тоже наблюдается такое жесостояние по серологиям. Клеточныйиммунитет, как гормональный иммунитет, теряется со временем. В настоящее время неизвестны сроки истощения клеточного иммунитета ЕКР,Вирус вакцины ЕКР не переходитплацентальный барьер, судя по негативным нейтрализующим премолоэивным образом сыворотки от восьми новорожденных жеребят, Кромеэтого, у 18 новорожденных жеребятот вакцинированных и зараженныхкобыл не был выделен положительныйвирус вакцины Ьц(яе Не а 1,Можно предположить, что кривые истощения пассивно приобретенногонейтралиэующего антитела ЕЙР, полученного от 5 жеребят путем выделения, неуклонно снижаются, непоказывая внутриутробного воздействия вируса Негреэ 1, так как,очевидно, не происходит активнаяиндукция антитела.Выделения вируса вакцины ЕДР чаще всего делаются из лейкоцитовкрови, а не иэ носовых раковин,Эти данные также относятся к введению вируса вакцины через нос.Хотя только четыре, принципа иэчетырех дали выделения, все выделения были сделаны иэ лейкоцитов крови, Многие носовые выделения вируса, полученные во время экспериментов, могут быть получены иэ незначительных количеств крови, выделенной из капилляров, поврежденныхпри взятии образцов длинными носовыми тампонами размером 150 мм,когда животные двигались. Образцынекоторых носовых тампонов были потеряны из-за бактерий и загрязнения,13 700069 14 Проверка сохранности вакцины ЕЙР и передачи вируса вакцины 512 256 128 512 256 512 512 1024 П 52 16 128 П 53 8 256 512 1024 128512 128 256 128 256 512 256 256 256 128 512 128 256 П 54 4 64 П 77 0 - 2048 512 256 256 128 1024 256 256 64 8 64 128 128 256 256 128 П 104 0 0 К 79 О 0 0 0 0 0 512 2048 2048 П р и м е ч а н и е. Ни одна из подопытных лошадей не имела клинических признаков ЕКР. Вгер 1 ососсо з ооер 1 дет 1 со з является частным сопутствующим агентом вируса ЕсцМе ЮипорпеовопЮз присутствие которого не вызывает удивления, если принять во внимание повсеместный характер этой популяции, Следовательно. любой серьезный стресс лошади может обусловить вспышку М"ер. юоер 1 дещсщ.Изобретение относится к вакцин,з и к способу ее приготовления. Рчрулентный изобят А 183 вируса Вц 1 пе 1 Иегрез вводится в моно- слой постоянной линии клеток Веро,который инкубируется в течение 3-5 дней при 37 С и цитопатология хлебток з авершаетс я, СвежеприготовленнЫй стабильный клеточный монослой клеток Веро инокулируется с частью приготовленного собранного вируса. Культура вновь инкубируется для получения цитопатологии по меньшей мере части клеток ткани, После зто" го часть полученного вируса серийно переносится по меньшей мере 30 раз при инкубационной температуре 26 С и.получается иьмуногенно активный авирулентный вирус.Т а б л и ц а 1х ф Ц Ц о .Ы о) 1 ф а Э е СО СО СО 3 О о СЧ СО л сч 3 С 3 Л с 3 СО сч сч о л + 1хХ сс лм ЭХсчо СЗЦ+влспо х сч 1 О ю ч о 3 л лс 3с 3 йеое ХХц Цо хо 1Х 1адеи 23 хах в оеецхеооИнодооох о х х сц