Способ получения иммуногена, стимулирующего иммунную систему человека, зараженного hiy

: %ЛЯ У П К 1) 4613460/136) РСТИЯ 88/01955 (09.06.88)2) 08,02.896) 30.08,93. Бюл. Ь 321) 2007522) 31.05.883) ОЯ1) Дзе Имьюн Респонс Корпорейш 2) Джонас Салк и Деннис Дж.Карло (ОЯ) 4) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММУНОГЕНА, ТИМУЛИРУЮЩЕГО ИММУННУЮ СИСТЕУ ЧЕЛОВЕКА, ЗАРАЖЕННОГО НЧ 7) Область использования; вирусология. ущность изобретения: предлагается неинекционный иммуноген, содержащий реровирусные частицы, лишенные белков аружной оболочки, или содержащий выИзобретение относится к борьбе с реовирусами, более конкретно к способу лучения иммуногена, стимулирующегомунную систему человека, зараженного; Ч Цель изобретения - создание высоко- фективного средства для борьбы с ретро- усами, преимущественно ретровирусом Пос емым его ражен о зара реде Р ой сывсупер оба влячение осле ч авленная задача решается предласпособом получения стимулируюммунную систему человека, ного НЧ, заключающимся в том, женные НГЧ клетки выращивают в М1640 в присутствии эмбриональоротки крупного рогатого скота, 5- натант фильтруют, к фильтрату ют/) -пропиолактон и инкубируют в 5 часов при 37 С и рН среды 7,2 - 7,4, его замораживают, облучают гамбранные антигены, выделенные из ретровируса. Также предлагается вакцина, эффективная против НЧ. В одном варианте осуществления изобретения иммуноген пригоден для иммунизации индивидуума. ранее зараженного ретровирусом, включая НЧ, с тем, чтобы индуцировать иммунозащитные факторы, защитные против развития заражения. Иммуноген может также использоваться для получения антител для пассивной иммунотерапии как таковой или в сочетании с активной иммунотерапией, у индивидуумов, заражен 1,ых ретровирусом, включая НЧ, предпочтительно тех индивидуумов, которые проявляют низкие уровни антител к продуктам ретровирусного гена иным, нежели наружная оболочка. 3 ил., 1 табл. ма-лучами, размораживают, концентрируют, пропускают через миллипоровые полисульфоновые фильтры, очищают вначале центрифугированием с 300/-ной сахарозой, затем центрифугированием в градиенте 30 - 450/,-ной сахарозы, а це .евой продукт получают ресуспендированием полученного осадка в РВИ буфере при концентрации 1 мл на 10 л исходного вещества.На фиг. 1 представлена схематическая модель НЧ.Как показано на фиг.2, геном РНК НГЧ кодирует три основных структурных гена: ца 9, ро и епч, которые фланкированы на обоих концах длинными концевыми дупликациями ( ТВ). Ген 9 а 9 кодирует специфические белки ядра, р 55, р 39, р 24, р 17 и р 15.Гены ро кодируют обратную транскриптазу р 65/р 51 и протеазу р 31, Гены епч кодируют гликопротеин наружной мембраны цр 120 иРего предшественник др 160, а также трансмембранный гликопротеин др 41. Некото.рые из генов являются чрезвычайновариабельными, в частности, гены епч.Кроме того, существуют пять других генов, не присутствующих в других ретровирусах, которые либо вовлечены втранскрипционную или трансляционнуюрегуляцию, либо кодируют другие структурные белки, Структура гена НЧ известна.Она описана Ратнером и др. Батоге, 313,стр.277 (1985),НГЧ присоединяется к клеткам хозяинапутем взаимодействия мембранных гликопротеинов с поверхностным рецепторомклетки, Оказывается, что при контакте НГЧс клеткой Т 4 протеин др 120 взаимодействует с рецептором С 04. Вирусная оболочказатем слияется с клеточной мембраной, ивнутреннее ядро вируса входит в зараженную клетку, где транскрипция РНК в вирусДНК катализируется обратной транскриптазой, Провирус может оставаться в клетке влатентной форме в течение нескольких месяцев или лет, и все это время зараженныйиндивидуум является бессимптомным. Однако, если вирус позднее активируется, вызывая вирусную репликацию ииммуносупрессию, индивидуум будет затемвосприимчив к условно-патогенным заражениям, включая рак, ассоциируемым соспидом,На фиг. 3 представлено схематическоевоспроизведение уровня некоторых антител и антигенов, присутствующих в развитии из бессимптомного состояния досостояния АВС(связанный со спидом комплекс) и до спида у НГЧ - сероположительныхпациентов, зараженных Н Ч.Результаты анализа по Вестерну иммуногена по примеру 1 показывают, что онсвободен от белков наружной оболочки прискрининге гомологичными и гетерологичными сыворотками, которые содержат высокиетитры антитела против белков наружнойоболочки.Как показано схематически на фиг.3, высокие уровни антитела против др 160/120наружная оболочка), которые присутствуютв бессимптомной фазе заражения НЧ, также продолжают существовать в симптомнойфазе. Уровень антитела р 24 в бессимптомной фазе является высоким, но, по-видимому, снижается в симптомной фазе.Аналогично, НЧ - сероположительные сыворотки содержат антитело, которое ингибирует функцию обратной транскриптазы, Упациентов, в которых антитело против обратной транскриптазы присутствует на высоких уровнях, попытки относительно10 выделения вируса менее часта положительны, нежели у тех, в которых оно отсутствует. Поэтому следует, что уменьшение клеточных и гуморальных иммунозащитных факторов, таких, как Т 4-клетки и антитела против ОАО, включая анти-р 24, и антитела против ро, включая антитело против обратной транскриптазы, связано с развитием Н доспида.Используемый термин "НЧ" включает типы 1 и 2 и является синонимом НТ Ч - ,АЧи .АЧ. НЧ относится к вирусу в общем смысле и включает все формы, подтипы и вариации.Используемый термин "белок наружнойоболочки" относится к той части мембранного гликопротеина ретровируса, котораявыступает за пределы мембраны, в противоположность трансмембранному белку,др 41. Белок наружной оболочки НЧ является синонимом др 120 и его предшественникадр 160,Используемый термин "др 120" или"др 160/120" относится к гликопротеинам,имеющим либо антигенную специфичность,либо биологическую функцию белка наружной оболочки; др 160, как полагают, являетсяпредшественником др 120.Используемый термин "генный продукт" относится к полипептиду или белку,который кодируется геном. Термин, какпредполагают, включает в себя белковыепроизводные, такие, как гликопротеины.Понятно, что в аминокислотную последовательность генного продукта могут быть внесены ограниченные модификации безнарушения биологической функции или им. муногенности генного продукта, и толькочасть первичной последовательности можетпотребоваться для иммуногенности.Идентификация НЧ - специфическихгенов и генных продуктов основана на терминологии НЧ типа 1, представленной нафиг.1. Предполагается, однако, что ссылкана специфический ген или генный продуктНЧ типа 1, на основе его молекулярной массы, будет также включать соответствующийген или генный продукт НЧ. типа 2 и, когдаприсутствует гомологичный ген, другие ретровирусы. Генные продукты других типов иродов могут иметь незначительно отличающиеся молекулярные массы. Например,др 41 НЧ типа 1 эквивалентен др 36 типа 2,тогда как др 120 типа 1 соответствует др 130типа 2.НЧ можно культивировать из пробы периферической крови зараженных индивидуумов, Например, одноядерные клетки изпериферической крови, такие, как лимфоциты, могут быть получены путем наслоенияобы гепаринизированной венозной кропо градиенту плотности Гсо 11-Нурацие и нтрифугирования пробы. Одноядерные етки затем собирают, активируют, наприер, фитогемагглютинином, в течение двух - ех дней и культивируют в подходящей еде, предпочтительно пополненной инрлейкином 2. Вирус может быть обнаруен либо анализом на обратную анскриптазу, анализом с захватом антигеа для р 24, иммунофлюоресценцией, либоектронной микроскопией для обнаружеия присутствия вирусных частиц в клетках. се эти методы хорошо известны специалиам в данной области. После выделения рус может быть включен в другие клетки.Важно использовать неинфекционнуюкцину с тем, чтобы избежать проникновеия инфекции в хозяина, Различные методы роша известны для придания болезнеорному организму неинфекционности. ирус можно инактивировать или сделать епликационно-недостаточным. Предпочтельно, однако, обрабатывать его комбиацией бета-пропиолактона и мма - излучения. При этом 3-пропиолакн должен находиться в контакте с вируом, как минимум, 2,5 часа, С тем, чтобы олностью удалить какой-либо остаточный ета-пропиолактон, бета-пропиолактон олжен оставаться в растворе в течение, как инимум, пяти часов при температуре 37 С,Выделенный .вирус затем обрабатыват так, чтобы удалить белки наружной обоочки. Такое удаление предпочтительно существляют неоднократными заморажианием и оттаиванием вируса в сочетании с изическими методами, которые вызывают абухание и сокращение вирусных частиц, отя также можно испольэовать другие фиические и нефизические методы, такие, как азрушение ультразвуком, в отдельности ли в сочетании друг с другом,Для иммунизации человека или живо- ного получаемый предлагаемым способом ммуноген применяется вместе со всоомоательными веществами. Но он можеттакже рименяться в своей водной форме без спомогательного вещества. При этом дозу ыбирают так, чтобы она была иммунологиески эффективной, и она, как правило, сотавляет от 1 до 100 мкг белка, редпочтительно, около 30 мкг белка.Активную иммунизацию осуществляют , предпочтительно, повторяют раз с миниальным интервалом, по меньшей мере, 90 ней, хотя дополнительные ревакцинации агут подходить в соответствии с измененими в уровне иммунной активности на осное, например, уменьшения количества 5 10 15 20 25 30 35 45 50 антител против НИ-генным продуктам, дру. гим, нежели белки наружной оболочки, Такую иммунизацию предпочтительно осуществляют первоначально путем внутри- мышечной инъекции с последующей внутри- кожной инъекцией, хотя может быть использована любая комбинация внутри- кожной и внутримышечной инъекции.Предпочтительно иммунокомпетентность или иммунную активность сероположительного индивидуума определяют перед иммунизацией с тем, чтобы определить подходящий путь лечения, В качестве метода такого определения сыворотки пациентов подвергают скринингу на присутствие антител против р 24 (например, при помощи иммуноферментного твердофазного анализа), антитела против обратной транскриптаэы и/или уровня клеток Т 4 при помощи хорошо известных методов. Пациенты, проявляющие индикаторы низкой иммунокомпентентности, например, низкие титры р 24 или антитела против обратной транскриптазы или низкие количества клеток Т 4, являются подходящими кандидатами для пассивной иммунотерапии, предпочтительно в сочетании (проводимой перед или совместно) с активной иммунизацией.Серонегативные индивидуумы могут быть вакцинированы с тгм, чтобы вызвать иммунозащитные факторы для предотвращения инфекции. Предпочтительно, вакцину вводят первоначально путем внутримышечной инъекции с последующим введением бустера, осуществляемым либо внутримышечно, либо внутрикожно. Физиологически эффективная доза содержит предпочтительно от 1 до 100 мкг, и более предпочтительно, около 30 мкг иммуногена. Вакцину предпочтительно вводят в сочетание с адъювантом, т.е. вспомогательным веществом, наиболее предпочтительно, адъювантом для обеспечения получения препарата типа "вода в масле". Различные подходящие адъюванты хорошо известны в данной области,Кроме того, поскольку антитела против др 160/120 могут содействовать вирусной абсорбции клетками, эти специфические антитела могут быть удалены из пациента, зараженного НЧ, перед иммунотерапией, Иммуносорбентные колонки, выполненные из полых целлюлозных волокон, модифицируют с тем, чтобы ковалентно связать лиганды, реакционноспособные с антителами против др 160/120, Такие лиганды включают антигены др 160/120, полученные из очи. щенных гликопротеинов, которые в свою очередь получены из только что собранных вирусных частиц или из культурального су 1837890пернатанта НИ-продуцирующих Т 4- лимфоцитов, Альтернативно, такие лиганды могут быть получены методами рекомбинантной ДН К с использованием трансфецированных клеток, Альтернативно, идиотипы, рекционноспособнце с антителами против 9 р 160/120, могут быть использованы для этих целей.Такие анти-идиотипные антитела могут быть полученц методами, хорошо известными в данной области.П р и м е р 1, Получение вирусных частиц. свободных от белков наружной оболочки,Клетки, зараженные штаммом НИ йо На 321 (выделившимся из плазмы 26-летней африканской женщины из Саира), выращивают в среде А, состоящей из ВРМ 1640 с 10-ной эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота, 25 мМ буфера НЕРЕЯ, 50 мкг/мл гентамицина и 100 мгк/мл стрептомицина.Культуры увеличивают в объеме путем подачи исходных клеток в центрифужные пробирки и доведения объема приблизительно до 8 л добавкой предварительно нагретой среды А. При этом степень разведения составляет приблизительно 1;5. Затем осуществляют второе разведение в соотношении 1:3. Супернатант от 5 - 7-дневной суспензии НИ-зараженных клеток фильтруют через фильтр размером 0,45 мкм. Свежеприготовленный раствор 1:40 бетапропиолактона прибавляют к супернатанту до конечной концентрации 1;4000, Раствор инкубируют в течение пяти часов при температуре 37. С и рН поддерживают на уровне 7,2-7,4,Через 5 ч 20 мл раствора супернатанта удаляют с тем, чтобы определить уровень инфективности и количество оставшегося бета-пропиолактона. Затем супернатант замораживают при температуре -70.С, Замороженный супернатант затем подвергают гамма-облучению кобальтом 60 мощйостью 4,5 мй,Раствор супернатанта затем оттаивают и концентрируют путем 40-кратной фильтрации через выполненные с молярной массой 100000 фильтры. Концентрат подают в снабженные мешалкой колбы Т, предварительно обработанные 70 -ным иэопропанолом, и центрифугируют при 28000 об/мин в течение одноо часа. Супернатант удаляют и осадок повторно суспендируют в содержащем ЭТУК натриевом буфере до общего конечного объема приблизительно 24 мл. 4 мл этой суспензии рэсслэивают нэд 8 мл 300 -ной сэхарозы в полиалломерных пробирках, предварительно обработанных707 О-ным изопропанолом, и центрифугируют втечение одного часа при 28000 об/мин. Супернатант сливают из 30%-ной сахарозц и осадок ресуспендируют в указанном натриевом буфере.Градиент в ультрасветлых центрифужнцх пробирках, предварительно обработанных 70-ным изопропанолом, устанавливают путем прибавления 3 мл 15%-й сахарозы в пробирку и наложения сверху 6 мл 30-й сахарозы, 3 мл вышеописанной суспензии наслаивают на раствор. Пробирки центрифугируют в течение 60 мин при 28000 об/мин.Раствор над слоями при 35 -ном переходе отсасывают пипеткой и сливают. Слои из всех пробирок соединяют в одной конической пробирке и разбавляют в соотношении 1:10 фосфэтсодержащим буферным солевым раствором, Растсор центрифугируют в полиалломерных пробирках, предварительно обработанных 70%-ным изопропанолом, в течение одного часа при 28000 об/мин. Супернатант удаляют и осадки в пробирках ресуспендируют в указанном фосфатсодержащим буферном растворе при концентрации 1 мл на 10 л исходного вещества,Альтернативно, особенно, когда иммуноген получают в больших количествах, стадию облучения можно осуществлять после объединения слоев, Затем вирус расслаивают на градиенте 15-50 о -ной сахарозы, Вирусные слои объединяют и ресуспендируют в вышеуказанном фосфэтсодержащем буферном растворе, Вирус центрифугируют при 28000 об/мин в течение одного часа и ресуспендируют в упомянутом буферном растворе до конечной концентрации. равной 1,0 мг/мл.Количество имеющегося белка определяют в соответствии с методом Бредфорда (см,Апай, Восйеа., 72, с.248, 1976). Белок разбавляют вышеуказанным фосфатсодер 45 5055 5 10 15 20 25 30 35 40 жащим буферным раствором до концентрации, равной 1,0 мг/мл,Уровень остаточного бета-пропиолактона в иммуногене определяют с использованием капиллярного газо-жидкостного хроматогрэфа. При этом приготовляют стандартные растворы бета-пропиолэктона и масляной кислоты, имеющие концентрации между 1 и 500 частями нэ миллион. Пробы объемом 2 мкм вводят в кэпиллярный хромэтогрэф в соответствии с рекомендацией изготовителя. Предел обнаружения составляет 0,1 ч/мл. Иммуноген содержит менее, чем 0,05 ч/мл, бета-пропиолэктонэ.Восемь проб иммуногена анализируют нэ содержание бета-пропиолэк 1 онэ капил 1837890 10л м с м с и 1 2 н У л 7 и б Ц У р в б с 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 рной газовой хроматографией, используя сляную кислоту в качестве внутреннего андарта, Используют следующие хрома- графические условия: колонка; 30 м х 0,25 , кварцевое стекло, открытая, тоубчгтая; ационэрная фаза; 1000 ь-ный цианопрол-кремний; температура ввода пробы 0 С; рабочая температура: 70 С/1 мин, 0 С/мин до 130 С; методика ввода пробы: расщепляющая. При вышеприведенных ловиях время удерживания бета-пропиоктона и масляной кислоты соответствует 52 мин и 6,70 мин, соответственно. Ввод 2 л 1 ч/мл. раствора бета-пропиолактона иводит к получению пика, который может ть измерен количественно. Концентрая 1 ч/мл раствора до 1/10 его объема ариванием растворителя при температу С при пониженном давлении не придит к ощутимой потери та-пропиолактона. Предел обнаружен пое концентрации составляет 0,1 ч/мл./0,1 кг/мл, С тем. чтобы подтвердить то, что муноген свободен от белков наружной алочки, иммуноген вначале разделяют на,00-ных полиакриламидных гелях с приенением додецилсульфата натрия в соот тствии со способом Лэммли, см,Багге 7, стр, 680, 1970). Очищенный материал тем переносят на нитроцеллюлозную буагу в соответствии с методом, предложеным Таубином и др. (см,Ргос, Батоге. Асас, с 76. стр. 4350, 1979) и иммуноокрашиват в соответствии с методом, предложеным Цанг и др. (см.Мей, Епгупаоцу, 92, р. 377, 1983 г.). Пятна полученного таким бразом иммуногена не имеют полосу, соотетствующую цр 120/160, как указано в кон, ,ольных испытаниях, при взаимодействии сыворотками, содержащими высокие титы энти-др 160/120.Коммерческие полоски с имеющимися э них белках НЧ, подвергнутые скрипингу гетерологичной сывороткой (шимпанзе 86-С и А - 3), и содержащие высокие титры нтител против белков наружной оболочки, р 160/120, являются негативными (нереакионноспособными) на полосках, полученых при анализе полученного ышеописанным образом иммуногена, своодного от наружной оболочки, Гомологичекие человеческие сыворотки (003 и 010), одеожащие высоко-титры антител против елков наружной оболочки, 9 р 160/120, явяются реакционно-способными с коммерескими полосками, но негативными с олосками, полученными из иммуногена, вободного от наружной оболочки, Как гоологические, так и гетерологические сывоотки вступают во взаимодействиес другими генными продуктами НИ. Отсутст вие белков наружной оболочки на предлага емом иммуногене подтверждают электронной микроскопией, К иммуноген ному препарату последовательно добавляют 2,5 -ный глутарэльдегид и осмиевый ангидрид, дегидратируют с помощью растворов этанола разных концентраций и заливают в ЕРОВ - 812, Тонкие шлифы получают с помощью прибораКВ М сго 1 оте (фирмаКВ, Уписала, Швеция) с использованием алмазного скальпеля. Толщина шлифов составляет 60 нм. Шлифы окрашивают уранилацетатом и лимоннокислым свинцом, наблюдают и фотографируот с использованием электронного микроскопа марки Цейс 109, Служащие в качестве контроля клетки, зараженные НЧ, подготовляют с использованием той же ме-. тодики. При этом обнаруживают, что иммуноген не имеет темно-окрашенную наружную оболочку, которая присуща контрольным пробам и которая отражает цр 160/120 на вирусной поверхности.П р и м е р 2. Иммунотерапия сероположительных индивидуумов. Девять пациентов, сероположительных к НЧ, лечат иммунотерапией при даче иммуногена по примеру 1. При этом иммуноген эмульгируют в соотношении 1:1 в неполном адъюванте фройнда в эмульсификаторе марки Ярех 8000 Мхег М инофирмы Спекс Индастриз Инк., США. 1,0 мл раствора, содержащего 100 мкг белка, вводят внутримышечно. Бустер 100 мкг белка беэ адъюванта вводят через 90 дней путем внутрикожной инъекции.Присутствие вируса НИ в лимфоцитах периферической крови пациентов определяют как до, так и после иммунизации путем сокультивирования вместе со свежеприготовленными лимфоцитами периферической крови, стимулированными фитогемагглютином и интерлейкиномв соответствии с методом Галло и др. (см.Си. МсгоЬ 25, с.1291, 1987). Оборудование для обнаружения присутствия антигенов НИ, таких, как р 24, коммерчески доступно (например, от инофирмы Е,И.Дю-Пон энд Де-Немурс Ко., Инк, США). Каждого пациента обследуют три раза перед иммунизацией и через 2,4,6,8,12 и 14.недель после иммунизации.В таблице представлены результаты исследований. Пациенты 010 и 003, из которых НЧ выделен перед иммунизацией, не проявляют выделяемый вирус вплоть до 12 недели после иммунизации. Пациенты 008 и 009 не являются переносчиками вируса вплоть до 8 недели после иммунизации. Все четыре этих пациента проявляют высокие1837890 12 2) Неатралиаующее аититело Мембр био иге т титры анти-р 24 ( 1:5000) и антитела против обратной транскриптазы ( 1;1000) перед иммунизацией. Остальные пять пациентов, которые проявляют низкие титры анти-р 24 и антитела против обратной транскриптазы перед иммунизацией, продолжают проявлять выделяемый вирус после иммунизации. Формула изобретения Способ получения иммуногена, стимулирующего иммунную систему человека, зараженного Н 1 Ч, заключающийся в том, что зараженные НИ клетки выращивают в среде ВРМ 1640 в присутствии эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота, 5-7- дневный супернатант фильтруют, к фильтрату добавляют Р -пропиолактон и инкубируют в течение 5 ч при 37 С и рН 5 среды 7,2-7,4, после чего замораживают,облучают у-лучами, размораживают, концентрируют, пропуская через миллипоровые полисульфоновые фильтры, вначале центрифугированием с 30 е-ной сахарозой, 10 затем центрифугированием в градиенте 3045 оа-ной сахарозы, а целевой продукт получают ресуспендированием полученного осадка в РВЯ буфере при концентрации 1 мл на 10 л исходного вещества.15роизводственно-издательский комби Патент", г Ужгород. ул, Гагарина. 1 каз 2879 Тираж По ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям 113035, Москва, ЖРаущская написноеоткрытиям при ГКНТ СССР 4/5