Способ определения брадикинина в сыворотке крови

ОП ИСАНИЕИЗОБРЕТЕНИЯК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ Союз Советски нСоцнапистнчесиихРвспубпии 11880411(5)М. Кл. А 61 В 10/00С 01 й 33/43 Ьеударствеиый квинтет СССР во делам изобретений н открытий:611-0185.(088.8)Опубликовано 15,11,81. Бюллетень М 42 Дата опубликования описания 15, 11, 81 72) Авторы(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ БРАДИКИНИНА В СЫВОРОТКЕ КРОВИ Изобретение относится к медицине и может быть использовано для диагнос. тики патологических состояний организма.Известен способ количественного определения брадикикина в плазме крови биотестированием на роге крысиной матки. Количество брадикинина данным способом определяют путем сравнения амплитуды сокращения гладкомьппечного препарата рога крысиной матки под действием брадикинина плазмы и брадикинина-стандарта 1.Однако данный способ не всегда позволяет определить концентрации пептида иэ-за низкого содержания бра 15 дикинина в плазме крови, особенно в случаях резкого преобладания про-, . цесса кининоразрушения над процессом кининообразования. Вводить же плазму в чрезмерно большом объеме в питательную среду с тест-органом нельзя, так как максимальное количест. во вносимой плазмы лимитируется обоскованными требованиями относительного постоянства суперфузионной среды:рН питательного раствора, ионныйсостав, ионная сила, окнотическоедействие и т.д. Введение больших объемов плазмы (1;1, 1;2) приводит к резкому сдвигу в составе суперфузионнойсреды, что отрицательно сказываетсянасократительных свойствах гладкомышечного препарата.Цель изобретения - повьппение чувствительности способа и уменьшениенеобходимого для анализа объема плазмы крови,Поставленная цель достигается тем,что перед введением в суперфузионнуюсреду с гладкомышечным препаратомбрадикинина плазмы и брадикининастандарта в нее вводят гепарин в количестве 0,05-5,0 ед/мл.П р и м е р . Известными приемамиосуществляют забор крови, подготовляют гладкомышечный препарат рогакрысиной матки и устанавливают порогбрадикиплазмы, нина,мл мг/мл гепарина в конечной контест-органовв мл плазмыи пг брадикинина/мп плазмы центрации,ед/мл 18 а 0 025 0 0,5 0 1,0 0 1,5 36 1,5 1080,25 18 72 2 108 18 1 О 18 18 1,0 (2) 36 72 0,5 36 36 36 0,05 а- порог чувствительности при биотестированииобычным методом;бф - порог чувствительности при использованиипотенцирующего эффекта гепарина. формула изобретения Составитель П.РубиноваРедактор К.Волощук Техред С.Мигунова Корректор Ю,Макаренко Заказ 9788/8 Тираж 690 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4 б 0 0,250,05 0,25 а 0 0250 0,5 0 1,0 б 0 0,5 Способ определения брадикинина в сыворотке крови, включающий введение в суперфузионную среду с гладкомьппечным препаратом брадикинина плазмы и брадикинина стандарта, измерение соответствующих амплитуд сокращений гладкомышечного препарата и их сравнение, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с фф целью повышения чувствительности способа и уменьшения необходимого для анализа объема плазмы крови,перед введением в суперфузионную среду с гладкомышечным препаратом брадикинина плазмы и брадикинина-стандарта в нее вводят гепарин в количестве 0,05-5,0 ед/мл.Источники информации, принятые во внимание при экспертизе1. Современные методы в биохимии. М., 1968, с. 208-213.где А - количество брадикинина-стандарта, внесенного в средус тест-органом, цг;Б - количество плазмы, внесенноев среду с тест-органом, мл;Нп амплитуда сокращения под действием внесенной плазмы, мм; 35Н - амплитуда сокращения под дей 5 Р.ствием внесенного брадикинина-стандарта, мм.В табл,1 представлены пороговые концентрации стандартного брадикини-. на, индуцирующие сокращения гладко- мышечного препарата рога крысиной матки в динамике с интервалом 30 мин.Из табл.1 видно, что чувствительность рога крысиной матки к брадикини ну триацетату при биотестировании не изменяется на протяжении 3 ч.В табл.2 даны пределы эффективных концентраций гепарина при выявлении их потенцирующего эффекта на сократительные свойства гладкомышечного препарата рога крысиной матки, индуцированного брадикинином триацетатом.Таким образом, иэ табл.2 видно,что диапазон эффективных концентраций, гепарина при биотестировании(бради 40 его чувствительности, внося в суперФузионную среду с тест-органом нанограммовые количества брадикининатриацетата (стандарт) . Затем определяют диапазон потенцирующих концентраций гепарина для данного тест-органа созданием конечной концентрации гепарина: 0,001, 0,005, 0,01, О,1, 1,0, 5,0, 50,0, 500,0 ед/мл с последующей регистрацией пороговыхи сверх-, 1 О пороговых концентраций брадикинина.Степень потенцирования определяют сравнением амплитуды сокращения тест- органа на одинаковые количества активного пептида в среде гепарина и с 15 предварительным введением гепарина.Далее выбирают диапазон максимально потенцирующей концентрации и проводя биотестирование плазмы введениемв среду с гепарином определенного , 2 О объема плазмы в сравнении со стандартным брадикинином, также протестированным в среде той же концентрации гепарина, Количество брадики - нина в плазме определяют по формуле, д пг/мл: 1 НХ )ГК кинина триацетата. равен 0,0001- 50,0 ед/мл. Максимально потенцирующие концентрации 0,01, 0,05 ед/мл.В табл.З приведены пределы эффективных концентраций гепарина при выявлении их потенцирующего действияна сократительные свойства гладкомьппечного препарата рога крысиной матки, индуцированного брадикинином плазмы крови. Таким образом, из табл.З видно,что диапазон эффективных концентраций гепарина при биотестированииплазмы крови равен 0,05-5,0 ед/мп.Максимально потенцирующие концентрации - 0,05; 0,5 ед/мн.В табл.4 представлены сравнительныеданные биотестирования брадикининаплазмы крови с использованием потенцирующего эффекта гепарина в сравнении с общепринятым методом.Из табл.4 видно, что при использовании гепарина в конечной концентрации 0,05-5,0 е мл амплитуда сокра. -щений значительно превышает амплитуду сокращений, полученных биотестированием обычным методом. Максимальноэффективные концентрации гепарина0,05; 0,5 ед/мл.В табл.5 дан порог чувствительности гладкомышечных препаратов рогакрысиной матки к брадикинину триацетату при использовании потенцирующего эффекта гепарина в сравнении собщепринятым методом.Из табл, 5 видно, что чувствительность тест-органов к брадикинину триацетату при использовании гепарина вконечной концентрации 0,05 ед/мл повышается в 2-8 раэ.В табл.6 приведен порог чувствительности гладкомышечного препаратарога крысиной матки к брадикининуплазмы крови при использовании потенцирующего эффекта гепарина в сравнении с общепринятым методом.1Таким образом, из табл.6 видно,что . чувствительность тест-органов к бради- кинину плазмы крови при использовании гепарина в конечной концентрации 0,05 ед/мл повышается в 2-6 раз по сравнению с биотестированием обычным методом. Минимально необходимый объем плазмы уменьщается также в 2-6 раз 0,5-0,25)мл против 1,0-1,5 мл плазмы при биотестировании обычным методом880411 Внесено в питательную средув конечной концентрации Амплитудасокращения,мм Равность амплитуд сокращений, мм Брадикинина, пг/мл 0,0110 Продолжение табл, 2 Разностьамплитудсокращений, мм Тест Внесено в питательную среду в конечной концентрации орган,Ф88041 14 Амплит сокращ есе Биотестирование, 9 аэностьмплитуд,мм епари конечй коназмы,центрации, ед 6 0 1,0 1,0 10 5 ф,05 абл Тест-,орган,В Амплитуд окращения мм гепарина ед/млаФ 00 0 0 1 б 0 Продолжениетабл.4 инятым методом;льзованием потенцирующего Порог чувствительнос ти тест-органов, пг/млФ50 50 0 100 100 10 50 0 50 0,05 50 а 0 25 0 50 0 50 б 0 0 25 0,05 а 0 50 0 100 100 12 б 0 50 0 50 0,05 12 50 0 10 а 0 20 0 0 80 40 0 0 80 0 7 б 0 10 0 10 0;05 10 а+- порог чувствительности .при биотестировании обычнымметодом;У"1- порог чувствительности при использовании потенцирующегоэффекта гепарина. Тесторган,У а 0 б 0 б 05 б 0 брадикинина,мг/мл Амплитудасокращения, мм Порог чувствительности тест-органовв мл плазмы ипг брадикини"на/мл плазмы 1, 5 1108) 0,25 (18) 1,0 (72) 0,5 (36) 1,5 (108) 0,25 (8) 1,5 (108) 0,25 (18)