Способ оценки кинетики клеточных популяций in viтrо

); гол:ц Р б У СВИДЕТЕЛ ВТО 4112462/28-1318.08.8615.01.89. Бюл, У 2Сибирский филиал Всеого центра психическАМН СССРЕ.А.Гуткевич976.35 (088.8)фавС 1 ег А БЬегшапрорц 1 ас 1 оп 1 с 1 песдсвпа 1 ердСЬе 1 цш оЕ СЬ0-439, 1959.(46) (71) науч вья (72) (53) (56) Се 11 Сева 17.4 оюзного го здор п СЬе дп шоцве. ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯПРИ ГКНТ СССР(54) СПОСОБ ОЦЕНКИ КИНЕТИКИ КЛЕТОЧНЫХ ПОПУЛЯЦИЙ 1 И 171 ТКО(57) Изобретение относится к биологии, в частности к изучению культивируемых клеточных культур. Цельюизобретения является упрощение способа и одновременной оценки продолжительности стадий клеточного циклаи распределения клеток популяций поэтим стадиям. Изобретение позволяетполучить оценки продолжительностипремитотической и синтетической фазымитотического цикла и распределения. клеток популяции по этим фазам. Оценки получают при исследовании клеточной культуры, выращиваемой в однойматрице, Монослойно культивируемыеклетки импульсно инкубируют с радио" активным предшественником ДНК. Культуральный матрац помещают в аппаратфракционирования и соединяют трубками с питательной средой, с коллектором фракций (Кф) и с коллекторомклеток для инкубации с флуоресцентным красителем (КК). Клетки, вступившие в митоз, фракционируют изпопуляции периодическим встряхиванием, Каждый раэ часть получаемойфракции перекачивают в КФ и.осаждают на фильтры для последующего определения радиоактивности. Вторую половину сливают в КК, окрашивают ипрокачивают через камеру для проточного счета люминесцентного микроскопа. В матрац закачивают свежую питательную среду и через определенноевремя повторяют всю процедуру. Поотношению радиоактивности каждойфракции к количеству клеток этойфракции определяют интенсивность синтеза ДНК (ИС). В результате по ИСи времени получения фракций определяют продолжительность синтетическойфазы, а затем продолжительностьпремитотической фазы. По количествуклеток во фракциях, получецных эавремя каждой фазы, оценивают распре-деление клеток популяции. 2 нл.,4 табл.)тиям при ГКНТ СС оиэводственно-полиграфическое предприя акаэ 7036/20НИИПИ Государствен113 о комитет , Москва,о иэоб 35, Ра тениям и отская наб Ужгород, ул, ПроектнаяИзобретение относится к биологии, в частности к изучению культивируемых клеточных культур.Цель изобретения - упрощение спо 5 соба и одновременной оценки продолжительности стадий клеточного цикла и распределения клеток популяций по этим стадиям.Увеличение информативности и уп рощения способа достигается за счет того, что исследуемую клеточную популяцию периодически фракционируют, извлекая в результате встряхивания нитотические клетки в виде фракций, 15 в которых определяют концентрацию клеток и их радиоактивность, по результатам этих измерений строят кривые изменения количества клеток и удельной радиоактивности от времени, 20 по которым определяют продолжительность пренитотической Г, синтетической Б и пресинтетической С, стадий клеточного цикла, распределение клеток ростовой фракции по этим стадиям 25 и распределение клеток,на протяжении этих стадий.Изобретение иллюстрируется следующими примерами.30П р и м е р 1. Используют две культуры фибробластоподобных клеток линий ФЭЧ-Л 22 и ЧЭЧ-Л 23. Клетки субкультивируют на протяжении 2 пассажей, Пересев клеток осуществляют стан,дартным способом, с использованием стандартных питательных сред. В экспериментальные матрицы засевают63,4 10 клеток/матрац, Взяты 1 матрац с культурой ФЭЧ-Л 22 и 1 матрац с культурой ФЭЧ-Л 23, Этап предфракционного культивирования составляет 23 ч. За 1 ч до начала фракционирования питательную среду в экспериментальных флаконах заменяют на среду того же состава, содержащую Н-тимидин (5 мКи/мл). Культуры клеток инкубируо ют в этой среде 60 мин при 37 С, отмывают от невключившегося предшественника ДНК тремя объемами свежей питательной среды и вновь добавляют 45 мл50 питательной среды. В качестве среды для фракционирования используют сре" ду стандартного состава. Этап фракционирования проводят по одночасовому циклу. Режим культивирования составляет 50 мин, режим фракционирования 10 мин. За время эксперимента было собрано 29 фракций клеток,Результаты приведены в табл.1 и 2.На фиг.1 и 2 представлены М- и Б-профили культур ФЭЧ-Л 23 ФЭЧ-Л 22 соответственно.Результаты расчетов промежуточных величин для оценки параметров продолжительности стадий клеточного цикла приведены в табл.3 и обозначены стрелками на фиг.1 и 2. Данные для оценки параметров распределения клеток ростовой фракции по стадиям клеточного цикла и для определения распределения клеток культуры в каждой стадии цикла представлены в табл.1 и 2 (столбец 9).Значения кинетических параметров для исследуемых культур приведены в табл,4.П р и м е р 2. Вычисление исходных величин.Исходными данными для расчета кинетических параметров являются ха" рактеристики митотического профиля (М-профиля), представляющего собой кривую, описывающую изменение количества клеток популяции, вступающих в митоэ в зависимости от времени получения фракции, и Б-профиля, который описывает изменение интенсивности включения радиоактивного предшественника ДНК (удельной радиоактивности) от времени получения фракции. В табл. приведены данные для построения М- и Б-профилей. Для выполнения расчетов параметров продолжительности стадий клеточного цикла количественный выход клеток и данные удельной радиоактивности преобразовывают по методу скользящего среднего. Кривые М- и Б-профиля строят по данным, приведенным в столбцах 7 и 8 (табл.1)Процедура оценки кинетических параметров(фиг.1) заключается в следующем.Из кривой, описывающей М-профиль, видно, что она представлена тремя пиками. Первый пик имеет максимум в точке "2 ч" и минимум в точке, соответствующей "3 ч" фракционирования, Второй пик имеет максимум, приходящийся на "5 ч" и два минимума в точках "3" и "10 ч". Третий пик имеет максимум в точке "16 ч" и два минимума в точках "10" и "22 ч".Кривая Б-профкля представлена двумя пиками, которые описываются(4) максимумами в точке "8 " и минимумами в точках "2" и "16 ч" и максимумом в точке "26 ч" с соответствующими минимума в точках "16" и5 "29 ч". Для вычисления параметров Т , Тз и Тс необходимо определить начало и окончание выхода клеток, находящихся в С, Б и С, периодах клеточного цикла (что соответствует пер О вому, второму и третьему пикам митотического профиля). Для определения интервалов времени, соответствующих вхождению в митоз С, Б и С субпопуляций клеток, кривые И- и Я-про филей аппроксимировали кусочно-линейными функциями. В общем виде эта процедура состоит в описании каждого пика М- и Б-профилей двумя линейными функциями 1 20 25 где 3 - коэффициент регрессии, характеризующий восходящуючасть пика;- время, в течение которогопеременная у увеличивается;- коэффициент регрессии, характеризующий нисходящуючасть пика;й " время, в течение которогопеременная у уменьшается.Приравнивая значения у и у нулю, находим точки начала и окончания пика. На фиг.1 рассмотрим второй пик кривой М-профиля (интервал между 3 и 1 О часами фракционирования). Восходящая часть пика начинается в точке, соответствующей 3 ч и продолжается в течение двух последующих часов, описывается выражением, которое является преобразованием уравнения (1) по данным примера (табл.1, стол" бец 7, 3-5 Фракции): у = 100,5 г - 183,3. (3) Нисходящая часть пика приходится на 5-10 ч фракционирования и описывается следующим выражением (на основе уравнения 2 и упомянутого примера): у = -62,8+ 611,1,где с - начало выхода клеток Б стадии клеточного цикла в митоэ, определяемое по М-профилю,- окончание выхода клеток Бстадии клеточного цикла вмитоэ, определяемое по Мпрофилю. Приравнивая у иу к нулю получаем оценкии Подобным образом вычисляются идругие промежуточные величины, необходимые для определения продолжитель.ности (Т, Т, Т) стадий клеточ"ного цикла. Ниже указаны условныеобозначения и определения этих величин М-профиль:С - начало выхода клеток Сстадии в митоэе - окончание выхода клеток Си6 астадйи в митоэ;й - начало выхода клеток Срстадии в митоз,- окончание выхода клеток С,стадии в митозБ - профиль,- начало выхода клеток Бстадии В митоэ- окончание выхода клеток Ястадии в митоз,"- начало выхода в митоз клеток,прошедших второй цикл./Расчеты , Г., й, по Я-профилювыполняют с использованием уравнений(1) и (2). Получив оценки девяти ве Ф Лличин (1с у з ф э ес1" ), определяют продолжительность периодов клеточного циклапо следующим формулам.П р и м е р 3Оценка параметровпродолжительности стадий клеточногоцикла.Продолжительность С стадии(10) 14511только нисходящую часть (фиг.1). В этом случае за начало С периода принимают начало Фракционирования,т.е. нулевая точка.Продолжительность Я стадии (Т).Т(9) 64 6137. И и 8,27 клеток, прошедших второй цикл.П р и м е р 5. Оценка параметров, отражающих распределение клеток популяции в каждой стадии клеточного цикла (3,, Р ),В общем виде эти параметры вычисляются по формуле для коэффициента линейной регрессии(14) 25где Т - начало 8 стадииТ" - окончание Я стадии.3Продолжительность С, стадии (Т ).1Т= - - - (12)2 1где Т; - начало С, периода,Т - окончание С, стадии.ЧВычисленные значения промежуточныхвеличин приведены в табл.3,Оцененные параметры Тс Тз, Тприведены в табл,4.П р и м е р 4. Оценка параметров,1характеризующих распределение клетокростовой фракции по стадиям клеточного цикла (ис 11 ч, ).35Для определения количества клеток,находящихся в каждой стадии клеточного цикла, используют вычисленныевыше оценки продолжительности каждойстадии клеточного цикла. Подсчет кле-ток, находившихся в каждой стадиицикла, проводят путем суммированияколичества клеток, полученных вофракциях за период соответствующейстадии клеточного цикла (Т, Тб,Т ). Для культуры ФЭЧ-Л 22 продолжительность стадии С, составила (1,16,4 ч (табл.4). Суммируя количествоклеток, полученных в первых шестичасовых фракциях и прибавляя клетки,полученные за 0,4 часа седьмой Фракции, получим за время С стадии в митоз вошло 1465,бк 10 з клеток (табл.2,столбец 9). Аналогичным путем вычисляют оценки количества клеток другихстадий клеточного цикла (ИЗ и Н,).Таким образом, структура ростовойфвакции исследуемой популяции клеток; И, - С)з где К - номер последней фракции клеток соответствующей стадииклеточного цикла- время получения фракций клеток соответствующей стадииклеточного цикла;у. - количество клеток соответствующей стадии клеточногоцикла, полученное к моментувремениНапример (табл.2, столб. 9), длякультуры ФЭЧ-Л 22 е; = Т = 1,1 ч,= Т, = 6 4 ч, Количество клетокСа кза это время увеличилось с у,208,8 к 10 з до ук = 1465,610 з клеток.Вычисленное по формуле (15) значениесоставляет 0,0012,Таким образом, используя предлагаемый метод, в одном экспериментеполучены три группы параметров. Этипараметры характеризуют проролжитель.ность стадий клеточного цикла, распределение клеток популяции по этимстадиям и распределение клеток внутри каждой стадии цикла. Формула изобретения Способ оценки кинетики клеточных популяций з.п чз.сто путем импульсного инкубирования с радиоактивным предшественником ДНК с последующей оценкой кинетических параметров, о т л и - ч а ю щ и й с я тем, что, с целью. упрощения способа и одновременной оценки продолжительности стадий клеточного цикла и распределения клеток популяций по этим стадиям, исследуемую клеточную популяцию периодически фракционируют, извлекая в результате встряхивания митотические клетки в виде Фракций, в которых определяют концентрацию клеток и их радиоактивность, по результатам этих из145 1164 тетической Я и пресинтетической С стадий клеточного цикла, распределение клеток ростовой фракции по С 8 и С, стадиям и Распределение клеток на протяжении С) Я и С 1 стадий клеточного цикла. Таблица 1 Времясбора,ч Объемфракций, мл Концентрацияклеток,кл./мл10) Радио- активКолиУдельная раНакопКоличествокл./фр.,кл. 1 0 чество кле/фр) кл. 10) ление,кл. 10 з диоактивностьсрт./кл.10) ностьфракциисрт./ил 6,0 715,5 0,38 45 15,9 5,96 74 65,6 12,4 793,2 2,16111,0 9,45 63,4 12)5 6)04 64 75,5 10,5 5,46 131 192 8 24 4,25 570,9 2,3 312 10 5,0 156 312 31,2 10 938,9 1004,9 1032,9 56 33,4 187 5,6 10 66 14,8 89 6,0 29,5 28 2,2466 2,32 56 2,96 54 12,5 1056, 1 23,2 24,1 10 10 1088,7 1174,5 1295,7 18,2 32;6 6,15 85,8 48 7,8 12 12,6 82,4 7,12 16 13 255,8 11 15,76 33 173,4 20,9 14 3,5 41 15 1,34 479,8 0,08 17 мерений вычисляют удельную радиоактивность) строят кривые измененияколичества клеток и удельной радиоактивности от времени фракционирования, по которым определяют продолжительность премитотической С) син 43,2 100 432 5,48 39 87,7 5 44,8 60 2245 83)76 6)3 418)5 Удельная радиоактивность срт/кл. 10 715,5285,5 7,76 781,1 233:2 6,08 138)9 266,7 13,56 822,9 144,7 17,750,0 25,9 39,1 22,8 27,9 23,9 47,2 16,2 68,7 10,5 115) 6 5,12 130,6 4)6 198,7 1,7 321)3 0,71 228)2 3)5 898)3145 1164 10 Продолжение табл 1 2 3 4 5 б 7 8 9 42 9 940,31014,3 178,2 3,9 7 6,0 54 5 14 8 40 б 136 91 18 74 2,781,6 20 34,8 10,5 21 30,4 11, г12,9 25 22 23 8,6 30,8 24 12,6 30, 9 209 20,9 26 11,4 36,8 14,4 20,1 21,8 18, г 1,9 7010 1,44 29 95 2 3 42 27 15,8 25,0 28 345,9 18,1 19 2 29 4226,9 Всего Таблица 2 Концентрацияклеток,кл./мл10 Времясбора,ч НакопОбъем фракКолиКолиРадио- активУдельная радиоактивность срт /кл 10 дельая раление,кл.10 чество кл./фр.10 з чествокл./фр.кл. .10 ностьфракцЬсрт./ иоак- ивнос рт./кл.10 5 117. Культура Параметры ФЭЧ-Л 23 ФЭЧ-Л 22 5,3 (1, 1-6,4) 2,2 (0-2,2)125 (3) 9 16 э 4) 111 3 (1 в 3 12 е 6) 5,5 (12,04-18,5) 6,3 (12,8-19,0) 793,2 (23,5 Х) 1465,6 (34,77) 1295,7 (38,4 Х) 1864)5 (44,17 1014,3 (39,1 Ж) 550,9 (13,07) Б второго цикла, кл к 10 0,998 С, Вр П р и м е ч а, н и е. В скобках время началаи окончаниястадии клеточного цикла. Т, чТ, чТ, ч