Способ получения биомассы микроорганизмов

ОП ИСАНИ ИЗОБРЕТЕН И б (.тй. (-:,э. М Р,1671 738 Совэ СоветсиихСоциапйстическийРеспублик К ПАТЕНТУ1) 8198/7 3 Опубликовано 30 оеударствеииый комитет СССР по делам изобретений и открытийописания 05.077 Дата опубликова Иностранцы,ц Эрнест Форестер Гаррисон, Джон Гарри Барри Нейл Герберти Стюарт Джозеф Вре(72) Авторы изобретения Дз уд Иностранная фирматернзшнл Рисерч Маатсхаппий (Нидерланды) 71) ЗаявитеШел,лОЛУЧЕНИЯ БИОМАССЫ МИКРООРГАНИЗ 54) спО Р 11019, ИС екМСЭВ Р 1102Р 11021,Новый вид бактерий содержит боль 5 ше протеина, а наличие в среде микроорганизмов, неусваивающих метанол, всмеси с микроорганизмами, усваивающимиметанол, приводит к появлению синергического эффекта, за счет которого10 увеличиваются скорость роста и выходмикроорганизмов по сравнению с условиями, в которых осуществляется культивирование только одних микроорга-.низмов, усваивающих метанол,15 Способ осуществляют следующим.образом.Иэ природных источников выделяют(выделение и характеристика приведены в примерах 1 и 2) смешанную куль 20 туру ЗМБ 72, состоящую иэ усваивающего метанол штамма Рвецйовопав ИСАВР 11040 (ЕБ) и чЕтырех не.усваивающих метанол микроорганизмов двух иэрода Рвецйовопав ЯСЭВ - Р 11019 (М 0)25 и Р 11022 (ЭЬ), штаька из рода Ас 1- пе 1 оЬас 1 ег БСЗВ Р 1102 (Сй) и штамма из рода Сцг 1 оЬас 1 ег 1 цв НСЭ ВР 11021 (РС) .Жидкая среда для выращивания3) культур содержит от 1 до 200 г/л ме-., Изобретение относится к мик б логической промышленности и к техники получения биомассы пу . тивирования микроорганизмов, п ляющих метанол,Наиболее близким решением к описываемому изобретению является известный способ получения биомассы микроорганизмов путем культивирова ния бактерий рода Рвецс 1 овопав, усваивающих метанол, в анаэробных условиях на жидкой питательной среде, содержащей метанол, способный к ассимилляции, источник азота и необходимые минеральные соли (1).Однако такой способ дает недостаточно высокий рост микроорганизмов и низкий выход биомассы.Целью изобретения является увеличение роста микроорганизмов и выхо- да биомассы.поставленная цель достигается опи-" сываемым способом получения биомассы микроорганизмов, в котором в ка- честве микроорганизмов, усваивающих метанол, используют штамм Рвецйовопав ИСЗВ Р 11040,. культивирование . которого осуществляют в. присутствии штаммов микроорганизмов, не усваивающих метанол: Рвецдовопав НСЭВ ЭВ Р 11022, Ас 1 пеСоЬасС 0 и СцгСоЬас 1 ег 1 цв МСЗВ671 Питательная среда может также содержать следы других элементов в виде солей, например, кальция марганГ 25ца, цинка, кобальта, молибдена, илибора. Примеры питательных сред приведены в примерах 1 и 4.Процесс можно осуществлять периодически, полунепрерывно или непрерывно, Когда процесс проводят непрерывно, то его можно начать согласнопериодической схеме или с использованием более быстрой йачальной стадии. При достижении равновесного со.стояния из питательной среды постоянно выводят микроорганизмы, в товремя как постоянный объем культурыподдерживают путем постоянного добавления свежей питательной среды,В непрерывном процессе концентрацию 40метанола во вспыливающей жидкостирастущей культурыподдерживают науровне роста независимо от количест ва метанола в среде, питающей культуры, и эта концентрация должна находиться предпочтительно на низшем-."уровне; йе превышающем 0,01 об/об,Микроорганизмы выращивают в бродильном сосуде, например, в аппарате с перемешиванием или с раэбрызгивателем, которые снабжают внутреннимили внешним охлаждением, Аэрациюкультуры осуществляют при помощи воздуха,кислорода или обогащенного кислородом. вбздуха,оТемпературу культуры поддерживают30-50 С, преимущественно 38-45 С, рнсреды - в пределах 6,0-8,0, предпочтительно 6,4-7,4, путем добавлениящелочи, например, ИаОН, КОН, МН ОНкислоты, например, Н 2 БО НР 04 .ф460Микроорганизмы извлекают из питательной среды одним иэ стандартныхметодов, например, флоккуляцией, седиментацией или осаждением с после-. тавола, предпочтительно от 20 до 100 г/л.В среде также имеются азотсодержашие соединения - такие, как аммиак, аммониевые соли, а также сульфаты или хлориды, нитрат, найрймер щелочного металла, или мочевина. Концентрация азотсодержащего соединения колеблется в пределах 3-50 г/л.В питательной среде могут.присутствовать также фосфор, сера, магний и железо. В качестве источника фос фора используют фосФаты, например,04 КН 2 Р 04 а МР 4 ан Р 04 (ИН 4) НРО или фосфорную кислоту концентрация которых находится в пре.делах 3-20 г/л. Источником серы мо жет "служить серная кислота или сульфат (ИН 4)2 Я 04 концентрацией 0,5-, 5,0 г/л. Металлы присутствуют в виде солей, например, МуЯ 04 7 М 20 (концентрация 0,2-2,0 г/л) и РеС 1 6 НО 20 (концентрация 0,01-0,1 г/л) . 738 4дующим центрифугированием или фильт.рацией, Биомассу затем высушивают ииспользуют в качестве источника протеина для пищевого сырья для животных и человека .П р и м е р 1. Выделение смешанных культур.Извлечение смешанных культур1 МЯ 72 иэ соответствующего сырья. Пи.тательная среда, используемая в этомметоде, обозначается как РСВЕ и имеет следующий состав, г/л:Метанол 5,0-50,02 НР 04 3,000КН 2 Р 04 3,000(ин) Бо 4,5-9,0Иа -цитрат 0,125МЧБ 04 " 7 Н 20 0,500Гес 13 6 Н 20 0,167СаС 12 н 20 0,660ЕпЯ 047 Н 20 О, 180СцЯО 7 Н 2 0 0,160пБ 04 4 Н 20 О, 150СОС 12 бН О 0,180Н 0,100Ба 2 МоО, 2 Н 0 О, 300Вода До 1 лрн среды поддерживают 6,8 путемдобавления щелочи, например, гидроокиси натрия.Лабораторный бродильный чан (рабочий объем 2,4 л) с РСВЕ средой прио42 С и рН 6,8 .подвергают вэбалтыванию и проводят барботаж воздухом(2 л/мин) . Затем проводят инокуляцию100 г образца ила, полученного из потока сточной водыиз выпускного отверстия в Я 111 пдЬоцгпе, Англия, идобавляют метанол с концентрацией0,5 об./об. Если наблюдают интенсивное помутнение культуры, добавляютеще метанол (0,5 об./об.), При дальнейшем увеличении помутнения в бродильный чан непрерывно подают РСВЕсреду, содержащую 1 об./об. метанола, при скорости разбавления 0,08 ч,При достижении равновесных условий,определяемых при помощи постояннойвеличины оптической плотности культуры, скорость разбавления постепенноувеличивают до 0,2 ч . Таким образом выделяют культуру, обозначенную.ЭМЯ 72.П р и м е р 2, Выделение и иден-,тификация типичной смешанной культурЬт (ИМЯ 72)1 млобразца культуры3 МБ 72,полученной по способу примера 1, извлекают из бродильного чана, помещают вмаленькие стеклянные бутылии разбавляют питательной средойРСВЕ, не содержащей метанол, до Концентрации 10 , 10или 10 , По 0,1 млобразцов извлекают из бутылей и помещают на агаровые пластинки с питательной средой РСКЕ и 1 аЬ 1 ещсо, Каждую пластинку накрывают колпачком,на который (в случае пластинок сРСВЕ) наносят небольшие количестваТаблица 1 Испытан Окраска и и яна лочка Пало иков Палоч к лочка поры Серый овныйветлоелтыйа крахальномгаре елты игм Диффузия пигмеи о ность воздух(кисло Слегк Слег Слегк Ч +;(ОР испытание1Рост на агареМС Сон Кеу Окисли- Окислительный тельны+ + кисли- ельный через7 дне ост на питательомагаре+ Рост на бульоне КСБ Йитатель- Пита ный агар ный++ Пи тат ный а Зависимость росттемпературы, фС 2+ о метиламин Гемолиз (кровянойагар) 5 671метанола. Пластинки затем перевертывают и термсстатируютпри 42 С 48 ч,Обследование пластинок по истеченииэтого времени показывает, что толькоодин вид микроорганизмов (обозначенный ЕИ) вырос на пластинках с РСВЕи что четыре вида микроорганизмов 5(обозначенные МУ, ГО, Л, СВ) вырастают на пластинках с агав Ьещсо. Используя петлю из платиновой проволоки, отдельные колонии каждого микроорганизма переносят на новые пластинки, содержаыие соответсвуюйую пит ат ельную среду, с цен ью получения чистых культур каждого вида,738 6Пять микроорганизмов, выделенных из 3 М 8 72, подвергают серии испытаний (1-30 в табл. 1) для определения, к какому виду микроорганизмов они относятся.Результаты испытаний предсавлены в табл, 1, .где (+) обозначает положительную реакцию в опыте, а (-) обозначае 1 отрицательную реакцию, Ка основании этих результатов четыре микроорганизма классифицируют следующим образом:МО Рэецйощопав эр. (НОВ 9 11019); РС Сцг 1 оЬас 1 ег 1 цщ (БСЭВ 9 11021); Э 1 Рвеийовопав (ИСАВ 9 11022); Сй Ас 1 пеЬасСег (МСЭВ 9 11020); ль- Питатель- ВСЙЕ + О, ар ный агар . ный мета671738 Продолжение табл, 1 Микроорганизмы е усваивающий метанол Испытание ила аэа рнитин декаСлегк ксилаза Переменный + Сл дола бозначен оуеэ Рго ет роста ет роста Образование Н ЯОбразование мочеви бесцв ивани Обесцвечивание Не истано ч-слегк Потребление цитрата + ет рост Нет рос+ ата осстановлени Рост на цери+ егк ученных результацировать усваиваорганиэм ЕМ (ИСЛВ Реакцию других изве деляют в не ты испытани Т аАнтибиот Я Б Лев омицети н Эритромицин Сульфафураз НовобиоцинОлеандомици Пенициллин Б Я Я Я томицин Я Сильно ЯТетрациклин- "-Цефалоридин Сильно анамици льфаметоксазолиметоприм мпилилли Налйдиноваякислота Линкомици изин декарбок ргинин дигидр дролиз желатина дролиз крахмала Рост на ксилозе(кислота) На основании тов нельзя класс ющий метанол ми Р 11040). микроорганизмов на ряд тных антибиотиков опрекольких опытах. Результапредставлены в табл. 2. блица 2671738 10Продолжение табл. 2 Антибиот фураэолидон итрофурантоинетициллинеомицинкситетрацикли уэидиноваяислота Клоксацилл льно листин ме ьно олимикс Я ьно Я бенициллитамицин Г ание: Я р и ример 3. Ом усваивающего мЕМ из ЭМЯ 72новка состоити, разделеннойой мембраной, ртальной секцииубки наполняют0,2-ным метанол ты с использо- танол микроорП де- икванигани у труб ализ ризо ти тл мик тывае из Н-образной а две части диэмещенной в горубки. Обе час мл ОСВЕ среом, В первой т и от ельных куляции.также провод уляции;е усваиваюмов - МП. косТь лучены слей оптической сть 11 трубк 1) ОП = 1,70 1) ОП = 2,05 1) ОП 11) ОП = 0,55 11) ОП = 0,06 11) ОП = 0 организмах 1 в конце;в указывают на рост микроорганиз огда ЕИ выращивают ю не усваивающих эмов МУ, РС, ЗМ, оказывают, что ве- микроорганизмом Результаты то, что наибо мов наблюдает в контакте со метанол микро СВ. Данные та щество, выдел опыт ьший я, к смес р,ган же и емое емы т части трубки проводят р допыта:Ц инокуляция микроорганизмов1 Ц то же;11 И контроль - без иноВо второй части трубкитри опыта:Ц контроль - без инок11) инокуляция смесью нщих метанол микроорганиэГС, ЭЕ, СВ;111)то же.В каждом эксперименте подующие данные по конечноплотности.(ОП):Часть 1 трубки Ча вствительный, К - стой ЕИ, способно диффундировать через30 лительную мембрану и поглощаться мроорганизмами МУ, ГС, Э 1 Сй,1, Чистые усваивающие метанороорганизмы выращивают во взбалмой колбе с 500 мл среды ОСВЕ и35 0,1 об./об. метанола, содержащегомеченые атомы С"4 . Колбу затем термостатируют при 42 фС на ротационномшейкере с орбитальным радиусом 2,5 спри 20 С. Образующуюся двуокись уг 40 лерода абсорбируют гранулами гидроокиси натрия, помещенными в трубке,подсоедийенной к колбе. Через двадня оптическая плотность культурыостается постоянной, что свидетельст45,вует об окончании роста, а в жидкости культуры не остается метанола.Культуру затем центрифугируют при10 000 об/мин и всплывающую жид.стерильно фильтруют;11, 100 мл этой всплывающей жидкости инокулируют 1,0 мл культуры7 МЯ 72, а затем культуру выращиваютво вэбалтываемой колбе по способу,описанному выше.На каждой стадии (1 и (11) изме 55 ряют радиоактивность, обусловленнуюприсутствием С"4;в начале опыта;в образовавшихся микров всплывающей жидкости60 в образовавшемся СО,На стадии (11) метанол отсутствует и рост микроорганизмов обусловленростом не, усваивающих метанол микроорганизмов в ИМЯ 72. Результаты опы 65 тов видны из следующей сх(сух.вес ающих метанолрганизмов х.вес) Общая биомас Таблица ниеа,корост бавле 76,2 79,0,400 2 30 0,23 949 0,319 76,88 80,60 б 0,46 0,47 426 0,54 5 7,589 О, 507 0,638 0,660 0,53 ыт вающим метанол ми РС. Результаты пр табл, 4. оорганиэм едены в Таким образом, рост не усваиваю-щих метанол микроорганизмов способствует увеличению общего выхода био- массы. Веществ о,выделяемое усв аив а" юййми йетанол микроорганизмами и необходимое для рота роорганизмо, не усваивающих метанол, представляет собой углеродный субстрат,П р и м е р 4. Непрерывная культура ЗМЯ 72, Семйлитровый бродильный сосуд с рабочим объемом 4,2 л загружают ПСЛЕ средой, содержащей 40 г/л метанола и инокулируют 100 мл культуры ЭМЯ 72, которую предварительно термостатируют при 42 С в течение одного дня. рН среды поддерживают на Вышеописанный эксперимент повторяют, используя усваивающий метанол микроорганйзм ЕБ и смесь ЕИ с не ус 0,08 г углерода в всплывающей жидкости0,409 г (сууровне 6,8, а температуру - 42 фС,Культуру перемешивают при 1000 об/мини аэрируют со скоростью 1 л/ч. Начало брожения проводят по периодической схеме до получения оптическойплотности культуры 1,5 (625 мм) .Непрерывную культуру получают прискоростй разбавления от 0,5 до 0,66 чРавновесное состояние поддерживают,по крайней мере, два дня при каждойскорости разбавления, исключая О,бб ч.Культуру в общем выдерживают 700 ч,Коэффициенты выхода биомассы иданные о содержании протеина в биомассе полученной при каждой скорости,б и стидин 298 5,00 инин одержании приведен Табл ц а Аминокис 9,41 9,67 4,29 4,60 спарагиновая о 3,18 3,33 9,84 10,13 ерин Глутаминовая 7 2,7 ли 5,63 5,6 6,78 7,0 и ла 15 2 5 75 92 7 21 4,54,8,10 0 13 1 Иэ сравнения данных в табл. 3 и 4 можно сделать вывод, .что смесь ЕЙ со всеми четырьмя не усваивающими метанол микроорганизмами дает более высокий выход биомассы на 1 г метанола, чем культура чистого ЕИ, или культура, содержащая ЕИ и только один из этих не усваивающих метанол микроорганизмов. Использование ЗМЯ 72 позволяет также проводить процесс при более высоких скоростях разбавле ния.Данные о с аминокислот в )МЯ 72 и ЕИ ы в табл, 5,Данные табл, 5 показывают, что З 0 присутствие не усваивающих метанол.существенно на содержание аминокислот в продукте.П р и м е р 5. Соотношение микроорганизмов в ОМЯ 72 при получении непрерывной культуры.Непрерывную культуру 5 МЯ 72 получают аналогично примеру 2. Во времяопыта определение количества бактерийпосевом на агар в чашках Петри проводят при каждой скорости разбавлениядля установления относительных размеров популяций различных микроорганизмов. Образцы культуры, взятые из бродильного сосуда, разбавляют стериль .ным солевым раствором (0,85-ным) доконцентрации 0,1 мл х 10/х 10 их 10 и по 0,1 мл разбавленных растворов помещают на высуШенные двойные Ьащ.Ьепсо пластинки. Пластинки термоста тируют при 42 С, а затем подсчитыва-.ют колонии раэлйчных типов микроорганизмов.Результаты представлены в табл.,б.Т а блица б20-19 8,0 190-24 0,17 33 0-265 1,5 2 0 0,0 404 ПримерследованияПериодическмикроорганизмасреды ОСЙ 2, сла, в 3-литродильном сосудлиэации послестижения пло.т 7 равйительные исученную культуру щивают в 2,41 л щей 1,5 метанобораторном бро С (беэ стери-.ии), После доток 3,0 г/л и по выр одерж вом л е при инок ности анноймикроляц кле Данные табл. б показывают, что во всех случаях большая часть биомассы состоит из усваивающего метанол микроорганизма ЕИ. Процетное содержание не усваивающих метанол микроорганизмов колеблется в зависимости от скорости разбавления от 0,8 до 7,6 от суммарной культуры.П р и м е р б;Непрерывная культура ЭМЯ 72 с использованием быстрой начальной стадии.Среда, йрймейяемая в этом опыте, имеет .следующий состав, г/л:ИагНР 04 3,000КНг Р 04 3,000(ИН 4)г ЯО 4 20,000МуЯ 04 7 Н 20 0,750РеС 12 6 НО 0,167Метайол80 (мг/л)Сас 12 н 20 5,3002 пБ 04 7 Й 0 1,400СаЯ 04 5 Н 0 1,300 671738 16 Продолжение табл. б МпЯ 04 4 Н 0 1,2005 СаС 1 г 6 Н 0 1,4000,800Иагмо 04 2 нго 2,400Вода До 1 (л)Семилитровый бродильный сосуд за-,гружают 4,2 л питательной среды, азатем инокулируют культурой ДАМБ 72,В начальной стадии получают концентрацию сухого веса клеток равную16 г/л,25 . Концентрацию метанола затем увеличивают ступенчато (приращение1,0 г/л) до получения концентрации"сухого веса"клеток 25 г/л в следующих условиях опыта: температура 42 С,ЗрН 6,6 (контролируют КОН), перемешивание при 1500 об/мин, аэрация51 л/мин, скорость разбавления 0,07 О, 3 ч",Результаты опыта приведены втабл е 7Та бл ца 7(сух,вес) непрерывную культуру полу" чают при скорости разбавления О, 05 ч В течение двух дней в культуре появо ляется.споронесущиймикроорганизм,и культуру промывают.В случае использования смешкультуры ЭМБ 72, споронесущий организм не появляется в культуре 300 дней, Данные опытов показывают,Формула изобретения Составитель А, БражниковаТехред О.Андрейко Корректор А, Гриценко Редактор Н. Хубларова Тираж 525 Заказ 3940/61 Подписное ЦНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Я(-35, Раушская наб., д, 4/5Филиал ППП Патент, г, Ужгород, ул. Проектная, 4 17 . 671 что смешанная культура имеет большую стойкость к инфекции, чем чистая культура усваивающего метанол микроорганизма.Непрерывно получают культуры микроорганизма ЕИ 2,41 л среды РСВЕ, содержащей 1 метанола, при рН 6,8 5 и 42 ф С. Наблюдается пенообразование, достигающее размеров, требующих добавления кремнийосновныХ противопенных агентов три раза в течение 6 дней.В случае проведения опыта с ис О пользованием ЭМЯ 72, введения противопенных агентов не потребуется в течение 100 днейСпособ получения биомассы микроорганиэмов путем культивирования бактерий рода Рзецдощоопаз, усваивающих 738 18метанол, в анаэробных условиях на жидкой питательной среде, содержащей метанол, способный к ассимиляции, источник азота и .необходимые минеральные соли, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью увеличения роста микроорганизмов и выхода биомассы, в качестве микроорганизмов, усваивающих метанол, используют штамм Рзеп-.Йопюпаз ИСЭВ Р 11040, культивирова- ние которого осуществляют в присутствии штаммов микроорганизмов, не усваивающих метанол; Рзеийощопаз ИСЭВ Р 11019, ИСДВ Р 11022, Ас 1 пеСоЬас 1 ег БСЮВ Р 11020 и Сцг 1 оЬас 1 ег 1 цв ИСАВ М 11021. Источники информации, принятые во внимание при экспертизе 1, Патент Великобритании Р 1270006, кл. С 6 Г, 1972,