Способ определения молекулярно-массовой неоднородности микробных полисахаридов

(19) И ОСУДАРСТВЕННЫИО ИЗОБРЕТЕНИЯМРИ ГКНТ СССР МИТЕТТНРЫТИЯ ОБРЕТЕЛЬСТВУ огни и(22) 16.09.86 (46) 15.01. 89. Бюп. Р (71) Институт микроби вирусологии им. акад. ного (72) С.К.Воцелко, Т.П И.Р.Малашенко, Т.А. Гр (53) 663.15 (088.8) (56) Но 1 ячагЬ С. Мо 1 оК хапЬап ро 1 узассЬа КезеагоЬ, 66, 1978, 1(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МОЛЕКУЛЯМАССОВОЙ НЕОДНОРОДНОСТИ МИКРОБНЬПОЛИСАХАРИДОВ(57) Изобретение относится к биотехнологии и касается исследования состава микробных экзополисахаридов.Целью изобретения является расширение технологических возмозностей способа за счет увеличения диапазона исследуемых .молекулярных масс. Способ заключается в том, что фракционирование растворов экзополисахаридов и стандартов молекулярных масс происходит в комбинированном градиенте солей ИаС 1 и СзС 1, взятых в соотношении 5:1-1:1, и плотности НаС 11,03-1,20 г/см, СаС 1 р1,2- 1,6 г/см при п = 30000 об/мнн в течение 19 ч. 8 ил., 2 табл.Из обр етение от но сит ся к биот ехнологии и касается исследования состава экзополисахаридов (ЭПС), образуемых различными видами микроорганизмов при культивировании их на угле 5родных субстратах.Цель изобретения - расширение технологических воэможностей способа засчет увеличения диапазона исследуемых молекулярных масс.Изобретение заключается в том,что для разделения полисахаридов(ЭПС) и растворов декстранов, при"меняемых в качестве стандартов молекулярных масс, используют комбинированный градиент солей НаС 1 и СяС 1,взятых в соотношении 5;1 - 1:1 припостоянном суммарном объеме, плотности растворов 11 аС 1 1 = 1,03-1,30 г/см 203= .30000 об/мин в течение 19 ч.Исследование растворов нативныхмикробных ЭПС исключает необходимостьпредварительного разделения ЭПС на 25Фракции и их раздельное градиентноецентрифугирование. Применение стандартов молекулярных масс (декстранов)значительно упрощает определениемолекулярных масс, не требует расчетов гидродинамических параметров. Использование комбинированного градиента ИаС 1 и СяС 1 позволяет определитьмолекулярную массу в диапазоне13 7 тыс - 2 млн Кроме того мер Ф35тод дает возможность одновременногоанализа нескольких микробных ЭПС(до 6-8 проб одновременно),Исследования молекулярно-массовойнеоднородности ЭПС, проведены насинтезированных культурой ХаигЬошоиая сашреягт.я шт, 8162 (а, 5), смешанной культурой дрожжей и бактерий на основе этанола (я, ) ксантанаФирмы "Ят.рва";, где: а- ЭПС, полученный на Ладыженском заводе Ферментных препаратов; б- ЭПС, полученный .в лабораторных условиях; 8, т- ЭПС,синтезированные при различных условиях культивирования.Стандарты углеводной природы -Юдекстр аны (фирмы "РЬагшаст.а","Регас","Р 1 и 1 са") различных молекулярных масс,используется при определении молекулярно-массовой неоднородности ЭПС,молекулярной массы отдельных компонентов ЭПС методами гель-хроматографии. Дпя упрощения анализа согласноспособу также предлагается применениеТ аблиц а 1 Ксан" Концентрация солей тан 687 6 е 44 7 ф 72 ИаС 1 0,05 М0,010 М 6,40 7,65640 7,70 6,85 6,81 декстранов в качестве стандартов молекулярных масс. Применяют декстраны фирмы "Г 1 п 1 са",мол.массой 13,7 тыс20 тыс., 110 тыс., 500 тыс., 2 млн.В соответствии с изобретением проведена проверкамолекулярных массдекстранов фирмы "Р 1 пЕа" методом аналитического ультрацентрифугирования(метод скорости седиментации). Молекулярную массу рассчитывают по уравнению Сведберга. Рассчитанные значения молекулярных масс декстранов неотличаются от значений, указанныхфирмой-изготовителем.Бприсутствии ЮаС 1 и СяС 1 свойства декстранов не меняются (не наб"людается ни деградация,их, ни структурирование).Используют в работе 0,057-ныерастворы ЭПС и 0,02%-ные растворыдекстранов. Центрифугирование осуществляют на центрифугах К,КМ, "ВесЬпап" в пробирках объемом 9,5 мп и 13,5 мп. Полученные результаты представляют на эмпирических кривых .молекулярно-массовогораспределения, где по оси ординат отложена интенсивность поглощения приЛ = 490 нм (реакция с фенолом исерной кислотой), а по оси абсцисс "номера фракций объемом 0,25-0,50 мпв зависимости от объема центрифужныхпробирок (фиг,1).Изобретение иллюстрируется следующими примерами.П р и м е р 1. Показывают стабильность реологических свойств и гидродинамических параметров исследуемыхЭПС в присутствии различных концентраций ИаС 1 и СяС 1.В табл.1 приведены данные по изменению вязкости 0,1 Е-ных растворовЭПС б,и ксантана "Яхцша" в зависимости от различных концентрацийБаСТ и СяСТ.1451166 Следовательно, в присутствии СвС 1 и ИаС 1 вязкость растворов исследуемых ЭПС, а также их гидродинамические параметры остаются неизменными, что свидетельствует о стабильности структуры ЭПС в условиях градиента. Следует отметить, что способ применяют для анализа микробных ЭПС, проявляющих свойства, аналогичные исследуемым ЭПС (т.е, стабильность структуры в присутствии ЯаС 1 и Св С 1) .1 Продолжение табл.1 КонцентРация, соответствующаяппот иост и 1,2 г/см 6,88 6 ф 43 7175СвС 1 0,005 М 6,83 0,010 М 6,85 646 7 ю 70 6,39 7,70 15 Конц ентр ация, со- ответствующая ппотности 1,6 г/см 6,87 20 6,47 7,70 25Таким образом, в присутствии солей ИаС 1 и СвС 1 вязкость исследуемых ЭПС не изменяется, т,е. не наблюдается ни деградация, ни структурирование ЭПС.В табл.2 приведены гидродинами 30 ческие параметры ЭПС о1 идродинамические свойства изучали в водных растворах на аналитической центрифуге МОМ6 методом скорости седиментации. Седиментацию проводили в 35 обычной ячейке при 48000 об/мин, диффузию - в ячейке с искусственной границей при 4000-8000 об/мин. Т а блиц а 240 Я 20И 10",С Д 20 см45 Вода0,005 МНаС 10,005 МСвС 1 0,70 5,50 5,45 0,70 50 0,65 5,50 Примеч ани е, Я 2 ОУ - конст ант а седиментации, Д 20 Ч - константа диффузии. 55 П р и м е р 2. Иллюстрируют флуоресцентной метки при определении молекулярно-массовой неоднородности нативного ЭПС в в комбинированном . градиенте МаС 1 и СвС 1 (вместо качест" венной реакции с фенолом и серной кислотой).Перед градиентным центрифугированием проводят обработку ЭПС в органическим красителем "ФИТЦ" ("Яегча")Проводят обработку нативного ЭПС, не разделенного на фракции. Осуществ". ляют центрифугирование меченого и необработанного (контрольного) ЭПС в комбинированном градиенте ИаС 1 и СвС 1, взятых в соотношении 1 Ф 1 при и = 30000 об/мин в течение 19 ч. Уровень свечения фракций "меченого" ЭПС измеряют на приборе ЛЙМАМ-И 2,. содержание углеводов во фракциях контрольного ЭПС определяют по реакции с фенолом и серной кислотой. На фиг.1 представлено молекулярно-массовое распределение ЭПС Ь в комбинированном градиенте МаС 1 и СвС 1(1 -меченый ЭПС, 2 - контрольный ЭПС).Таким образом, применение реакции с фенолом и серной кислотой для анализа содержания углеводов во фракциях не ведет к снижению качества анализа по сравнению с использованием флуоресцентной метки.П р и м е р 3. Показывают молекулярно-массовое распределение ЭПС и декстранов в комбинированном градиенте МаС 1 и СвС 1, взятых в различных соотношениях при п- 30000 об/мин в течение 19 ч (плотность растворов ИаС 1, 1 = 1,03 - 1,20 г/см , СвС 1, р = 1,20-1,60 г/см ) На фиг.2-4 показано молекулярно-массовое распределение ЭПС о,Е, Ь,и декстранов в комбинированном градиенте плотности ИаС 1 и СвС 1, взятых в соотношении 1:1 (фиг.2), 2:1 (фиг.3), 5:1 (фиг.4).5 14На фиг.5 показано молекулярно-массоное распределение ЭПС, синтезируемого ХапТЬошопав сашревгхя шт.8162 в комбинированном градиенте плотности солей БаС 1 и СвС 1 при их соотношении 2:1 (А,1), 51 (А,2), 1,4:1 (А,36).Как видно из фиг.2-4, изменяя соотношение солей БаС 1 и СвС 1 в зависимости от поставленной экспериментаторои задачи, можно более де" тально исследовать те или иные компоненты ЭПС различной молекулярной массы. Так, увеличение объема растворов ИаС 1 (соотношение НаС 1 и СвС 1 5 ф 1) даст возможность четкого разделения низкомолекулярных составляющих (до 500 тыс.)(фиг,4), в то время как увеличение объемов растворов СвС 1 (соотношение ИаС 1 и СяС 1 2:1, 1;1), обладающих более высокой плотностью, позволяет успешно разделить высокомолекулярные фракции от 500 тыс. до 2 млн. (фиг,2 и 3). Аналогичные выводы можно сделать исходя из кривых молекулярно-массового распределения, представленных на фиг.5.П р и м е р 4, Показывают возможности использования предлагаемого метода для анализа ЭПС, синтезируе-. мых культурами-продуцентами ЭПС в различных условиях культивирования с целью выбора оптимального режима для получения ЭПС с заданными свойствами (фиг.3, фиг.5, пример 3).П р и м, е р 5, Показывают целесообразность применения комбинированного градиента плотности солей ЖаС 1 и СяС 1 для анализа ЭПС.На фиг.б показано молекулярно-массове распределение ЭПС, синтезируемого смешанной культурой дрожжей и бактерий в градиенте плотности ИаС 1 (А) (и = 30000 об/мин, 4 ч (2), 19 ч (1) и в комбинированном градиенте плотности солей ИаС 1 и СяС 1 (Б) (п = 30000 об/мнн, 19 ч) при соотношении ИаС 1 и СяС 1 2:1 (3) и 1:1 (4).Применение растворов БаС 1 более высоких плотностей ( р = 1,03-1,20 г/см, р = 1,03-1,05 г/см) позноляет получить молекулярно-массовое распределение компонентов с мол. массой 20 тыс. - 500 тыс., т.е. в этом случае удается расширить нижнюю границу определяемых молекулярных масс от 180000 до 20 тыс. 51166 6Время центрифугиронания, равное4 ч,является недостаточным для разделения компонентов ЭПС по сравнениюс центрифугированием в течение 19 ч5(фиг.бА). Для разделения компонентовЭПС с мол.массой более 500 тыс.использовали растворы СвС 1 плотностью р = 1,20-1,60 г/см (фиг,бВ).П р и м е р 6. Показывают возможность одновременного расширения нижнего и верхнего пределов диапазонаопределяемых молекулярных масс прииспользовании комбинированного гра 16 диента ЯаС 1 и СяС 1,Как указывалосьв примере 5, применение градиентов с плотностью у =1,03-1,20 г/см позволяет расширить нижнюю границу определяемых мо 20 ,пекулярных масс до 20 тыс., введениеСяС 1 плотностью= 1,20-1,60 г/см,в градиент дает возможность анализавысокомолекулярных компонентов(500 тыс., - 2 мпн).2 В В данном примере в качестве стандарта молекулярных масс, кроме применяемых ранее, используют декстран смолекулярной массой 13,7 тыс,На рис,ба предстанлено молекулярЗ 0 но-массовое распределение ЭПС В прицентрифугировании в комбинированномградиенте ИаС 1 ( р = 1,03-1,20 г/см,)Эи СвС 1 ( р = 1,20-1,60 г/см), взя-тых в соотношении 5:1, в течение19 ч при и = 30000 об/мин.Применение комбинированного гради-.ента НаС 1 и СвС 1 для ЭПС позволяетрасширить как нижний предел определяемых молекулярных масс (менее20 тыс, по сравнению с применениемградиента растворов хлористого натрия), так и верхнюю границу диапазона молекулярных масс (500 тыс,2 мпн).При этом результаты, представленные на фиг.ба, согласуются с полученными ранее (см,пример 3, фиг.4 в).Наличие пика в первой фракции ЭПС 6(фиг.4) соответствует фракции смол.массой 13,7 тыс., как показано вданном примере.П р и м е р 7. Показывают соответствие результатов, полученных при применении предлагаемого метода для55анализа микробных ЭПС и гель-хроматографии. На фиг,7 представлен элюционный профиль ксантана "Яхрома" пригель-хроматографии на колонке с сефарозой 4 В (размеры колонки 0,910 И И М 2 ь б в го гг г гб гв юоНсиера фракций иг.1 7 145 80 см). Элюент 0,3 М 11 аС 1, Содержание углеводов в собираемых фракциях (по 1 мл ) определяют по реакции с фенолом и серной кислотой, По оси абсцисс отложен объем .выхода в 1 мп (либо номера фракций, так как объем фракций 1 мп). На фиг.8 представлен калибровочный график зависимости объема выхода декстранов от их молекулярных масс (1-2 мпн., 2 - 110 тыс., 4 - 70 тыс., 5-.40 тыс.) на колонке с сефарозой 4 В (0,9 х 80 см),Кривая молекулярно-массовогораспределения ксантана "Бцрпа",полученная в результате градиентного центрифугирования (фиг,4 д)точно соответствует профилю элюцииксантана при гель-хроматографии(фиг.7). Кривые молекулярно-массового распределения, полученные приградиентном центрнфугировании, являются зеркальным отражением элюционных профилей ЭПС, полученных пригель-хроматографии, так как при.гель-хроматографии высокомолекуляр.ные фракции элюируются ранее низкомолекулярных, а при градиентномцентрифугировании наоборот, т.е.высокомолекулярные компоненты содержатся в последних фракциях,1166 8Значение молекулярных масс отдельных компонентов ксантана, определенные методом гель-хроматографии(фиг.4 д), совпадают. Таким образом,применение предлагаемого метода неснижает качества анализа микробных, ЭПС по сравнению с гель-хроматографией.Формула изобретенияСпособ определения молекулярномассовой неоднородности микробныхполисахаридов, предусматривающийприготовление раствора хлористого 15натрия, внесение в него исследуемогообразца с последующим проведениемультрацентрифугирования до максимапьного разделения образца по молекулярной массе и анапиэом полученны фракций, о т л и ч а ю щ и й с я тем,что, с целью расширения технологических возможностей способа за счет увеличения диапазона исследуемых молеку лярных масс, в раствор хлористогонатрия перед внесением образца вводятраствор хлористого цезия в соотношении 5;1 - .1:1 при постоянном суммарном объеме, при этом раствор хлористого натрия имеет плотность ,03 30 з1,20 г/см , а хлористый цезий - 1,201,60 г/см .1451166 алунин Редактор Корректор Н.Корол олуженко 037/21Государственног113035 Т СССР и от аб.,венно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная,роизв Зака ВНИИПИ Со ст авит ель Техред Л.Сер Тираж 500омитета по изобретени осква, Ж, Раушская ХМ Рюш Подписно тиям пр 4/5