Способ получения антибиотика 6270

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСНРЕСПУБЛИК 8014 ЗСЕСОМ 9 Р 4 й ИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИ РффаЛЕО 7 ПАТЕН си ГОСУДАРСТ 8 ЕННЫИ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ(72) Йоко Касукабе, Нобуко ТаАкио Сейно и Ясуо Ивагайа (ЗР(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИБИОТ 1) 4 С 12 Р 1/06//(С 12 Р 1/О С 12 К 1:О 1)(57) Изобретение относится к новому антибиотику 6270, к способу его получения и применения в качестве антикокцидиозного средства или в качестве пищевой добавки для ускорения роста домашних животных и птицы. Целью изобретения является выделение микроорганизмов, обладающих антибиотическими свойствами. Способ заключается вкультивирований штамма ИосаМ 1 орз 1 з зр.ГЕКМ ВРна питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли при температуре 30 С в течение 96 ч с последующим выделением и очисткой целевого продукта, 4 табл.Изобретение относится к новомуантибиотику 6270, к способу его получения и применения в качестве антикокрщиозного средства или в качестве пищевой добавки для ускорения роста домашних животных и птицы.Целью изобретения является выделение микроорганизмов, обладающих антибиотическими свойствами.Штамм Иосагдорэдэ эр. 6270 депонирован в Исследовательском ферментационном институте Японии под номеромГЕКМ ВР Морфологические характеристики.1Субстратный мицелий хорошо развити разветвлен, поэтому ширина каждогомицелия составляет примерно 0,4 мкм.Воздупптый мицелий хорошо растет внекоторых культуральных средах, таких 20как сахарозо-нитратная агаровая культуральная среда (Дифко. Агаровыйраствор Чапека), крахмальная агаровая культуральная среда (1 Б Р,Дифко-Неорганический солевой крахмальный агар), культуральная средаовсяная мука - агар (1 Б Р) илиглюкозо-аспарагиновая агаровая культуральная среда, Воздушный мицелийявляется прямым или искривленным ивнешний вид колонии паутинистый (вцелом они образуют паутину). При созревании воздушный мицелий имеет ширину от 0,4 до 0,6 мкм. У стареющейколонии через 10 дней после начала35культивирования воздушный мицелий подвергается фрагментации и образуетдлинные споровые цепи, каждая из которых содержит по крайней мере10 спор. Споровые цепи не являются 4спиральными. Поверхность спор гладкая, споры имеют цилиндрическую форму, Их размер составляет примерно0,4 1,2 мкм, Нет спорангия, наблюдаются склероции или синнемы. 45Культуральные характеристики.Тесты проводят в соответствии собщепринятым методом испытаний,Цвет определяют под стандартнымисточником освещения ксеноновой лам 50пой.Приведенные ниже данные относятк условиям роста при культивированииов течение трех недель при 28 С наагаровой пластинчатой культуральнойсреде. Показатель а указывает рост,55показатель Ь указывает состояние воздушного мицелия, показатель с указы"вает растворимый пигмент и показатель Й - наличие других характеристик.Сахарозо-нитратная культуральнаясреда (Агаровый раствор Дифко-Чапека):а) хороший, сероватый,(2 ва);Ь) белый, порошкообразный;с) нет.Глюкоэо-аспарагиновая культуральная среда:а) хороший, светло-желтый (Здс)до бежевого (Зде);Ь) сероватый (Зва);с) нет.Глицерино-аспарагиновая культуральная среда:а) слабый, (2 ва);Ь) слабое образование;с) нет.Крахмало-агаровая культуральнаясреда:а) отличный, 3 дс до БЬа 1 е (Зса);Ъ) белый порошкообраэный;с) нет;Й) гидролиз крахмала: отрицательно.Тирозно-агаровая культуральнаясреда,а) слабый (38 е)Ь) нет;с) нет.Питательная агаровая среда (Дифко,Бакто-питательный агар):а) слабый, светлая пшеница (2 еа)Ь) нет;с) нет.Дрожже-солодовый экстракт агаровая культуральная среда:а) отличный, трещины (сгас 1 з) топаз (Зпе);Ь) белый;с) нет,Культуральная среда с овсяной мукой:а) хороший, оболочка (эЬе 11) (2 са); Ь) 2 Ъа;с) нет.Физиологические характеристики.Интервал температуры роста. Не наблюдают рост ниже 5 или выше 39,5 С. Оптимальная температура 27-38 С.Разжижение столбика глюкозо-пептоно-желатиновой культуры: поло;кительно.Гидролиэ крахмала: отрицательно.Коагуляция и пептонизация снятого молока: нет коагуляции и существенной пептонизации (37 С),3 1409Образование меланина: 1 БР - тироэиновая агаровая культуральная среда;отрицательно; 1 ЯР - тирозиновая культуральная среда с бульоном дрожжевогоэкстракта: отрицательно; 1 ЯР - пептоно-дрожже-железистая агаровая культуральная среда; отрицательноТолерантность МаС 1: нет роста при4 Х и выше.Растворимость ксантина, гипоксантина, аденина: отрицательно.Использование источника углерода(баэальная среда Прайдхэма и Готтлиба) .15Положительно: П-глюкоза, Ь-арабиноза, Э-ксилоэа, салицин,Слабо положительно: Р-фруктоэа,сахароза,Отрицательно: иноэит, Ь-рамноэа,раффиноза, Э-маннит.Штамм 6270 идентифицируют какштамм, принадлежащий к ИосагдорззМейер 1976 среди октиномицетов, таккак наряду с упомянутыми различнымихарактеристиками он образует длинныецепи спор в воздушном мицелии, а гидролизат целых клеток содержит мезодиаминопимеровую кислоту и галактоэу,но не содержит арабиноэы и мадурозы,кроме того не определяется миколеваякислотаПри осуществлении способа микроорганизм, продуцирующий антибиотик6270, культивируют в соответствии страдиционными методиками культивирования известных актиномицетов. Однако с промышпенной точки зрения выгодно применять метод культивирования с аэрацией - перемешиванием. В40качестве культуральной среды для продуцирования могут быть применены материалы, обычно используемые длякультивирования актиномицетов. А именно могут быть использованы в подходящих сочетаниях различные источникиуглерода, источники азота и органические и неорганические соли, а также противовспенивающий агент при необходимости. Температура культивиро 50вания обычно лежит в интервале от 25о одо 35 С, предпочтительно около 30 С.Время культивирования может менятьсяв зависимости от различных условий.Однако обычно накопление продуцированного антибиотика 6270 достигает55максимума через 72-148 ч.Антибиотик 6270 может быть выделен из культуральной среды и очищен 132 4при использовании его физико-химических свойств с помощью традиционных методик, таких как метод использования различия в растворимости примесей, метод использования различийв адсорбции ионообменными смоламиили различными адсорбирующими агентами, метод экстракции органическимрастворителем, не смешивающимся сводой, или же сочетание различныхсредств, таких как осаждение, удаление примесей, диализ, сушка и перекристаллиэация.Например, антибиотик 6270, полученнйй в культуральной среде, извлекают следующим образом. После добавления фильтрующей добавки, такойкак диатомитовая земля или Радиолит700, культуральный бульон фильтруюти фильтрат и микробные клетки соответственно экстрагируют подходящимирастворителями, такими как этилацетат и ацетон. Затем объединяют клеточный экстракт и экстракт из фильтратаОтгоняют растворитель из этогоэкстракта, в результате получают антибиотик 6270 в виде сырых кристаллов, сырые кристаллы подвергают, например, хроматографии. Элюат концентрируют при пониженном давлении,а остаток растворяют в подходящемрастворителе, таком как этилацетат,а затем обрабатывают разбавленнойсоляной кислотой, Слой растворителяконцентрируют, в результате антибиотик 6270 кристаллизуется в виде свободной кислоты,Для получения натриевой соли упомянутый слой растворителя обрабатывают разбавленным раствором солянойкислоты, а затем разбавленньс раствором карбоната натрия, слой растворителя концентрируют, в результатеполучают антибиотик 6270 в виде натриевой соли. Полученный таким образом антибиотик 6270 в. виде свободной кислоты или натриевой соли можетбыть перекристаллизован из подходящего растворителя, такого как н-гексанэтилацетат, чтобы получить чистыекристаллы. Антибиотик 6270 в видесвободной кислоты обладает следующи"ми свойствами,Бесцветные иглоподобные кристаллы,кислотное вещество.Точка плавления: 115-118 С.Элементный анализ найдено,7:С 62,72; Н 9,49; О 2778, 5 1Удельное вращение:- 11,5(С 1,О, метанол),УФ-спектр поглощения.Не наблюдается максимумов полоспоглощения при 2 О нм или более приизмерении метанольного раствора,Характеристические полосы поглощения (см-) в ИК-спектре (таблеткас бромистым калием): 3470, 2980,2945, 2890, 1735, 1460, 1380, 1315,1165, 1102, 1075, 987, 980.Растворимость: растворим в метаноле, этаноле, этилацетате, хлороформе,эфире, ацетоне и бензоле; нерастворим в воде,11 ветные реакции, положительно вреакции с ванилином - серной кислотой и в реакции Драгендорфа; отрицательно в реакции с нингидрином; окраска с 1газообразным.Тонкослойная хроматография: (на25 Фкизельгуре СР , производимом фирмой Мерк Ко):Система растворителей Величина КХлороформ:метанол(20:1) 0,49н - Гексан-этилацетат(1:1) 0,08Бензол"этилацетат (1:1) 0,04Хлороформ-ацетон (2:1) 0,36н-Гексан-этилацетат (1:3) 0,13Этилацетат 0,22Н-ЯМР-спектр: наличие трех метоксигрупп наблюдается при с 1 ппм3,39 (ЗН ), 3,49 ( 6 Н ), спектр снятпри ОО ИГц в тяжелом хлороформе сиспо,пьзованием ТМС в качестве внутреннего стандарта.1 С-ЯМР-спектр: результаты измерений при 25 МГц в тяжелом хлороформе с использованием ТМС в качествевнутреннего стандарта. Согласно этимрезультатам общее число атомов углерода равно 44.Антибактериальный спектр приведен в табл.1. Антибиотик 6270 обладает особенно сильными антибактериальными свойствами против грамположительных бактерий и является полезнымкак антибактериальный агент.В низких концентрациях он обладает антикокцидиозной, акарицидной ипротивовирусной активностями и является полезным как антикокцидиозноесредство для домашней птицы, такойкак куры, перепела, утки, гуси и индейки, и для домашних животных, таких как коровы, свиньи, кролики, буйволы, козы и овцы, в качестве агентадля лечения диарреи домашних живот 409132 ных или в качестве агента для увели чения эффективности питания или для ускорения роста домашних животных и птицы,1 П р и м е р 1. Засевают 1 л культуральной среды (рН 6,0), содержащей 6,0 Е глюкозы, 2,07, соевой муки, 1,07,Согц 1 а дрожжей и 0,5 Ж карбоната каль 10 15 20 25 30 35 40 4550 55 ция, штаммом Иосагс 1 орз 1 з вр. 6270о (РЕКМ ВР) и культивируют при ЗОС 48 ч. Этим культуральным бульоном засевают 100 л культуральной среды, имеющей указанный состав, и культивируют при 30 С в течение 96 ч при перемешивании в аэрации в сосуде,имеющем емкость 200 л. Скорость аэрапии составляет 100 л/мин, а скорость вращения мешалки равна 250 об/мин. После добавления фильтрующей добавки (Радиолит 700) этот культуральный бульон фильтруют для разведения филь- трата и клеток. Затем фильтрат экс трагируют 40 л этилацетата, а клетки экстрагируют 30 л ацетона. Ацетоновый клеточный экстракт концентрируют при пониженном давлении для удаления ацетона и экстрагируют 20 л этилацетата. Этот экстракт объединяют сэкстрактом из фильтрата и объединенный раствор концентрируют при пониженном давлении. Остаток адсорбируютна колонке, заполненной 750 г силикагеля (Вако-гель С) с хлороформом, и через колонку пропускают смесь хлороформа иметанола (100:1). Активную фракцию концентрируют при пониженном давлении досуха, в результате получают маслянистый остаток, Затем остаток растворяют в небольшом вор на колонке с Сефадексом 1.Н,заполненной ацетоном, и элюируют ацетоном, Полученную таким образом активную фракцию концентрируют для получения сырых кристаллов антибиотика 6270. Кристаллы растворяют в э гилацетате и встряхивают с разбавленной соляной кислотой. Этилацетатный слойконцентрируют при пониженном давлении, Образовавшиеся кристаллы перекристаллизовывают из смеси н-гексана и этилацетата, в результате получают 23,4 г свободной кислоты антибиотика 6270 в виде бесцветных иглоподобных кристаллов, Полученная таким образом свободная кислота антибиотика 6270 обладает упомянутыми физико-хиколичестве ацетона и адсорбируют раст 1409132мическими и биологическими характеристиками,П р и м е р 2. Антикокцидиоэнаяактивность.Антибиотик 6270 однородно смешивают со сложным кормом для кур, чтобы получить заранее определенную концентрацию. Полученный таким образомкорм свободно поедается курами в течение двух дней до инокуляции ооцитами и до конца испытания (восемь днейпосле заражения).Для сравнения используют Ионенсин,который является известиным антикокцидиозным препаратом,Используют цыплят в возрасте 7 дней,которых содержат в условиях полногопредохранения от кокцидиоэной инфекции по 5 в группе.Ооциты, использованные для заражения, представляют собой чувствительный штамм Еппега йепе 11 а. Каждому цыпленку инокулируют полностью выросшие ооциты (310 ) орально с ис 4пользованием металлического зонда.Результаты представлены в табл.2.Эффект от применения средства определяют по Антикокцидиальному Индексу (АС 1), который рассчитываютпо следующей формуле:АС 1(Относительное увеличениевеса + доза выживания)-(ооцитная величина + показатель заболеваемости);120 или менее: как антикокцидиозный агент неэффективен;160 или менее: слабо эффективен;160-180: умеренно эффективен;180 или выше: очень эффективен.(д) Относительное увеличение веса.В конце испытания определяют увеличение веса (а именно вес в концеиспытания - вес во время заражения)каждой испытуемой группы и вычисляют относительное увеличение веса наоснове веса контрольной группы(100),которая не получает антикокцидиозноесредство.(1 д) Ооцитовый индекс,Число ооцитов в слепой кишке под"считывают через Ц дней после заражения путем гомогенизации кишечного ка"нала. Ооцитовый индекс определяютследующим образом,Число ооцитов, най- Ооцитовый инденных в кишечном дексканалеО,О-О, О ОО, в ,0 10 1 1,0-5,0 10 105,0-11,0 10 20Показатель заболеваемостикишечного канала.Испытуемых цыплят анатомизируютв конце опыта (8 дней после заражения) и исследуют кишечный канал не О вооруженным глазом, чтобы определитьпдкаэатель заболеваемости, Показательзаболеваемости определяют, как приведено ниже, а величина заболеваемости была определена в десять раэ, так 16 же как и величина показателя эаболеваемости.О,(-) Кишечник совершенно нормальный. Если найдено пятно крови, (-) меняется на (+),1,(+) Кишечник нормальный по форме. Его содержимое слегка жидкое ижелтоватое. Обнаруживается слабое набухание частично на слизистой мембране кишечника, который становится25беловатым.2, Кишечник обычно нормальныйпо форме, Набухание наблюдают на всейповерхности сяизистой мембраны. Всодержимом крови не найдено. Слизьслегка желтоватая и поблекшая. Наслизистой мембране обнаружено немного белых некротических пятен или кровяных пятен.3, Кишечник заметно усох и35 изменен по форме, он немного длиннее,чем прямая кишка. Содержимое совершеино аномально и часто кишечник заполнен свернувшейся кровью или белосерым, творогоподобным перерожденным40 веществом. Стенка кишечника заметнонабухшая и легко рвется, а иногдаеще остаются пятна крови. Болезнь затрагивает основание кишечника, ноне прямую кишку.45 4, Усыхание и деформация кишечника являются значительными, Кишечник выглядит подобным колбасе поформе и не длиннее прямой кишки. Болезнь поражает треть или четвертьпрямой кишки.Группы 1-3 получают. корм, содержащий заранее определенную концентрацию антибиотика 6270, начиная за 66 два дня до инокуляции ооцитов. Группа 4 для сравнения получает корм, содержащий антибиотик Ионенсин. Группа 5 представляет собой зараженную, не получавшую лекарства контрольную1409 32 группу, инокулированную ооцитами.Группа б представляет собой незараженную контрольную группу, не получавшую лекарства.Из этих результатов испытанийвидно, что антибиотик 670 обладаетантикокцидиоэной активностью.П р и м е р 3. Тест на эффективность корма на свиньях. 1 ОИспользуют свиней пород 1,апд.Основной корм:а) с начала испытания до четырехнедель: 607 зерна (кукуруза, пше,ница,ячмень), 15% соевого жмыха, 157 корма животного происхождения (порошокснятого молока, рыбная мука), и 10%другого (ферменты, карбонат кальция,фосфат калия, хлористый натрий и др,);б) от 4 до 12 недель: 787 зерна 20(кукуруза, ногоплодник ржавый, пшеница), 137. соевого жмыха, 57 рыбноймуки и 47. других (карбонат кальция,фосфат кальция, хлористый натрий ит,п.).25Методика,Разделяют на три группы 15 поросят 35-дневного возраста, в каждойгруппе по пять свиней, таким образом,чтобы сред 1 ий вес был одинаковым. З 0Антибиотик 6270 добавляют к основному корму в количестве 0,12.5 и 25 млндолей (ппм) соответственно. Три группы свиней кормят кормами соответственно 12 недель. Затем измеряют вес 35телаи потребление корма,Далее подсчитывают общее числодней, во время которых свиньи страдали от диарреи в течение четырехнедель от начала испытания. Результаты приведены в табл.З.Показатель потребности в пищеулучшается на 5-87 при кормлении кормом, содержащим антибиотик 6270, Пов,.пление веса улучшилось на 5-117. 45Кроме того, наблюдается, что диарреяу свиней существенно снизилась.ОП р и м е р 4. Зффек гивносг корма у жвачных.Используют бычков породы Гольштейн.Концентрированный корм: 71,57, зерна (кукуруза, ногоплодник ржавый) тпдго (ячмень) 11,5% мякины и отрубей (кормовая клейковина кукурузы, пшеничные отруби, масляный жмых рисовых отрубей), 5,5% жмыха растительных масел (соевый жмых, жмых от льняного масла) и 11,57 другого ( арахисовая мука, меласса, фосфат кальция, хлористый натрий).Методика.15 кастрированных бычков в возрасте 8 месяцев разделяют на три группы по пять бычков в каждой таким образом чтобы средний вес был одинаковым. Добавляют антибиотик 6270 к основному концентрированному кормув количестве 0,7,5 и 15 ппм соответственно. Три группы бычков кормятэтими кормами соответственно. Крометого, высушенную рисовую соломускармливают в качестве сырого кормав количестве 1 кг на бычка, Результаты показаны в табл.4. Показатель потребности в концентрированном корме улучшается на 7-10% при кормлении кормом, содержащим антибиотик 6270. Прибавка веса увеличивается на 9-11%. Формула изобретения Способ получения антибиотика 6270,обладающего противококцидиозным действием, заключающийся в культивировании штамма Хосагс 11.орз 1.з зрРЕЕМ ВРна питательной среде, содержащей источник углерода, азота и минеральные соли при 30 С в течениео96 ч с последующим выделением и очисткой целевого продукта,)100 Тест-микроорганизм Вас 111 цв сегецв ТАМ Вас 111 цв сегсц 1 апв 1 РО 3329Васг 11 ив вцЬг 11 я РС 1 219Мдсгососсив г 1 ачив ТРО 3242 Загспа 1 цсеа КТО СгарЬу 1 ососсив ацгеивРВА 209 РЗСЯгарЬу 1 ососсцв ацгецв(устойчив к стрептомицину,канамицину, хлорамфениколу итетрациклину) К 1 еЬве 11 а рпецвопае РС 1 602Ргогеия чц 1 Вагдя ОХ Рвеийовопав аегцддпояа 1 РО МусоЬассег 1 цщ вверпагдя АТСС 607 МусоЬассегыв ач 1 цв ТРО 3153МусоЬасгегдцв рЬ 1 е 1 1 НЗ Репс.11 ыв сЬгувояепцв 0-176 Аврегд 11 цв Г 1 ачця АТСС 9643СосЬ 1 оЬо 1 ив в 1 уаЬеавевА 1 Гегпаг 1 а ваг 1СапдЫа а 1 Ьсапв Ю 3 1200 ЯассЬаговусея сегечваеЯгга.и 77 ная ингибирующая концентрация,мкг/мл1409132 Таблица 3 Группа КолнчадннЯ в на СреднееколичестИндекспотреб"ности внорма е Улучвевне ннство антнбноа средго ваза пее нсаннл,во норма, съеденноенсаотраб 6270,добавлен" воакорм( ) од,кг го во ара мл нспыности в корнее,456 84 во арама периода испытаний орма, съеден ае колнчас Ф Показатель потрабностн пнин арама перпода нспмганн лмчениа веса Улвчиение показателя поребностн в пююа, Й Покаатель потребности пиюеа когда был добавлен 6267пище,когда не былдобавлен антибиотик Показатель потребности абл па лучщение окаэател Поквэат потребн Среднее количество едн потребносв конценттрного конце за пер од, кг центриро ванном ко рованном корма нно се ер 7,5 320 15 318 0 323 2 7,618 0 8, 256 ф Показатель потре в концентрированнкорме испытаимй сти н -рс с аь съеденного во е колич прибавка веса за время испытаний Улучаение показателяпотребности в концентрированном корне Показ Показ ь потреб отребностиантибиотик тель Г.Ма М. Ходанич Соста Техре о Корректо М.Максимишин едактор А.Воровнч аказ 336 одписное ир омитета СССРоткрытийая наб., д. ИИПИ Госупо деламосква рственногоОбретений иЖ, Раушс 1 ЗОЗ, М роизводс;венно-полиграфическое предприятие оличесто аитибиоика 6270 обавлеиого в орм (ппм Средний вес в начале испытания,кг пытаний,к 23 О 23602320 Обвае число днеЯ, когда кандан группа страдала от днаррен об" иеа число днеЯ во время нспытаннандоЯ гругп корме когда прибавлен 6267корне, когда не добавляли город, ул. Проектная, 4