Способ получения сорбента на основе целлюлозы

(71) Заявятел ститут эпидемиологии 511) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СОРБЕНТ.ЦЕЛЛОЛОЗЫ СНОВЕ являетсв колон иммунос не прот олу- пособью изобретения я высокоемкого пре ропускать ток жид тавленная цель д гласно способу п е р 1, Приготг свежеприготов створяют в 50 мл бавляют 6,0 г цолученного из х ляется арата, кости. стигает лучения ие ша Приков 4,88 ( ) еннои1-нойллюлозногоопчатника ени ного Пя тем, сорбен НОН и дорошка,о с Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способу получениясорбента для специфического связывания антител и антигенов,Известен способ получения иммуносорбента на основе суспензии .целлюлозы, полученной переосаждением измедно-аммиачного раствора. Эти иммуносорбенты благодаря большой общейповерхности частиц обладают высокойемкостью, т,е. способны присоединятьбольшие количества антител 1,300900 мг йа 1 г сорбента )13.Однако их существенным недостаткомя невозможность использованияках, так как через слой такихорбентов водные растворы почтиекает,оГиологии им. Н;Ф;1-амалеи Фта на основе целлюлозы, включающемупереосаждение целлюлозы из ее медноаммиачного раствора с последующимиактивацией и коньюгацией с белком,0,5-6,03-ный раствор целлюлозы, эмульгированный в смеси бензола и хлороформа при ихсоотношении 1:2,5 в присутствии 0,1-0,Ц полиэтиленсорбитанмоноолеата переосаждают введением в 6-83- Оный раствор серной кислотыв ацетоне.После присоединения белка к такимпористым целлюлозным шарикам был получен иммуносорбент,обладающий и высокой емкостью,и способностью пропускать ток растворителя.На чертеже схематично изображеноустройство, реализующее предлагаемыйспособ.3 968039 (СП:200). Раствор осветляют центрифугированием в течение 10 мин при 3000 об/мин и используют для приготовления шариков двумя способами:1. Получение шариков эмульгированием. 75 мл медноаимиачного раствора целлюлозы помещают в сосуд А, емкостью 0,5 л, куда налито 150 мл смесихлороформ-бензол (1:2,5),содержащей 0,15 мл поверхностно-активного .ве о щестаа (полиоксиэтиленсорбитанмонолеат-Твин). В сосуд опускают мешалку и смесь эмульгируат 5 мин при ИО об/мин, После окончания эмульгирования смесь выпускают через нижний 1 отросток сосуда А непосредственно в регенерирующий раствор (100 мл ацетона и 32 мл концентрированной серной кислоты ), налитый в сосуд Б (см. чертеж), Через 10 мин жидкость сливают, а образовавшиеся шарики отмы.вают 10 объемами воды. Продукт фракционируют путем оседания в цилиндре и отделяют фракции, содержащие частицыразмером 100-280 мк.25.2. Получение шариков распылением.75 мл 6 Ъ-ного медно-аммиачного раствора целлюлозы, в который Добавлено 0,075 мл поверхностно-активного вещества полиэтиленсорбитанмоноолеат-Твин).распыляют через пульверизатор при избыточном давлении 0,25 атмосферы в 200 мл ацетона, содержащего 10 мл концентрированной сернойкислоты и помещенного в 0,5 л колбу с низким горлом. Затем жидкость сливают, а частицы промывают 10 объема ми .воды. Продукт фракционируют путем оседания в цилиндре и отделяют Фракции размером 150-120 мк.Активирование носителя, К 1 г отмытых целлюлозных пористых шариков добавляют 100 мл 0,2 М Ма 30,1. Реакционную смесь слегка перемешивают 30 мин при комнатной температуре в4 темноте. Окисленные шарики промывают на воронке Бюхнера 200 мл воды и хранят в воде, Окисленный продукт остается активным и может быть использован по крайней мере в течение 6 мес,50 Сочетание с белком. 1 г активированных целлюлозных пористых шариков промывают на воронке Бюхнера 200 мл 0,1 И карбонат-бикарбонатного буфера (рН 9,0) и добавляют к ним в разных случаях 25,100 или ч 00 мг белка раст-. воренного в 10 и этого же буфера. Для сочетания использовали иммуноглобулин 46 кролика (Эц С, ), который может являться как антигеном, так и антителом. Смесь оставляют на 16-18 ч при 1 С, После окончания сочетания избыток жидкости удаляют на воронке Бюхнера и препарат промывают 1 объемом 0,853-ного раствора МаСР. Затем к осадку для восстановления добавляют 100 ил 0,2 М МаВН в 0,85 о 0-ном растворе МаСЗ. Восстановление проводят в течение 1 ч при комнатной температуре. Препарат последовательно отмывают Й 500 мл 0,85-ного раствора МаС 1, ИО мл 0,01 н. НС У содержащей 0)853-ной МаС 2 и 200 нл 0,853-ной МаС 1. Полученный иммуносорбент хранят в 0,853-ном растворе МаС 1 при ч 0 СПри необходимости длительного хранения к нему добавляют мертиолят до концентрации 1:10000.П р и м е р 2. Приготовление шариков. 1,88 г свеиеприготовленной Со 10 Н1 растворяют в 50 мл 153-ной МНдОН и добавляют 1,5 г целлюлозного порошка, полученного из линта хлопчатника, Раствор осветляют центрифугированием в течение 10 мин при 3000 об/мин и используют для приготовления шариков двумя способами:1. Получение шариков эмульгированием. 75 мл медно-аммиачного раствора целлюлозы помещают в сосуд А,емкостью 0,5 л, куда налито 150 мл смеси хлороформ-бензол 11:2,5 ), содержа-щей 0,6 мл поверхностно-активного вещества (полиоксиэтиленсорбитанмоноолеат - Твин). В сосуд опускают мешалку и смесь эмульгируют 3 мин при 190 об/мин. После окончания эмульгирования смесь выпускают через нижний отросток сосуда А непосредственно в регенерирующий,раствор (400 ил ацетона и 16 мл концентрированной серной кислоты ), налитый в сосуд Б. вЧерез 10 мин жидкость сливают, и образовавшиеся шарики отмывают 10 объемами воды, Продукт фракционируют путем оседания в цилиндре и отделяют фракции, содериащие частицы размером 100-280 мк.2. Получение шариков распылением.75 мл медно-аммиачного раствора целлюлозы, в который добавлено 0,3 мл поверхностно-активного вещества полиоксиэтиленсорбитанмоноолеат-Твин), распыляют через пульверизатор при избыточном давлении 0,25 атмосферы в 200 мл ацетона, содержащего 8 мл кон.цен рированной серной кислоты и поме5 9680 щенного в колбу на 0,5 л с низким горлом. Затем жидкость над частицами сливают и их промывает 10 объемами воды, Продукт Фракционируют путем оседания в цилиндре и отделяют Фракции В размером 160-120 мк.Активирование носителя. К 1 г отмытых целлюлоэных пористых шариков добавляют 100 мл 0,2 И йаЭО 4 . Реакционную смесь легко перемешивают 30 мин 1 О при комнатной температуре в темноте. Окисленные шарики промывают на воронке Бюхнера 200 мл воды и хранят в воде. Окисленный продукт остается активным и может быть использован по 13 крайней мере в течение 6 мес.Сочетание с белком. 1 г активиро. ванных целлюлозных пористых шариков промывают на воронке Бюхнера 200 мл 0,1 М карбонат-бикарбонатного буФера 20 рН 9,0 и добавляют к ним в разных случаях 25,100 или ч 00 мг белка,растворенного в 10 мл этого же буФера. Для сочетания использовали иммуногло-.-Таблица 1 Форма носителя Извлечено Ат мгна 1 г сухого,препарата Концентрация целлюлозы Количество белка е ж Добавле- Фиксироно, мгlг валось,мг/г В растворе, В части- В цах, 3 152. 0 7 Суспензия 1,0целлюлозы 100 чОО 193 6,0 Пористыецеллюлозные шари- ки 100 288 28 100 1,7 3,0 292 100 80 25 0,7 1150 100 е мКоличество целлюлозы в 100 мл свободно осевших частиц. осветляют центриФугированием в течение 10 мин при 3000 об/мин. Полученный 1 Ф-ный раствор целлюлозы используют. для приготовления шариков. П р и м е р 3, Приготовление ша 5 ри ков 1,20 г свежепри готовленнои Сд(ОН) растворяют в 150 мл 153-ной МН 4 ОН, добавляют 2 г медицинской хлопкойой воды (гигроскопичной ). Раствор 39 6булин ч кролика (Зсб , который может являться как антигеном, так и анти- телом. Смесь оставляют на 16- 18 ч при 1 С. После окончания сочетания избыток жидкости удаляют на воронке Бюхнерапрепарат промывают 1 объемом,85/-ного раствора МаСУ. Затем к осадку для восстановления добавляют 100 мл 0,2 М МаВН 4 в 0,853-ном растворе МаСВ. Восстановление проводят в течение 1 ч при комнатной температуре. Препарат последовательно отмыва:,ют 500 мл 0,853-ного раствора НаСФ, 100 мл 0,01 н, НСЙ,содержащей 0,853- ,ной МаС 7 и 200 мл 0,853-ной.йаСУ. Полученный иммуносорбент хранят в 0,853-ном растворе МаСФ при 1 С. При необходимости длительного хранения к нему добавляют мертиолят до концентрации 1:10000.гСравнение иммуносорбентов на основе известной суспензии и пористых шариков представлено в табл. 1.В табл, 2 и 3 приведена характерис тика иммуносорбентов на основе целлюлозных пористых тел. 7 96803Получение . шариков эмуль гированием.75 мл медно-аммиачного раствора целлюлозы помещают в сосуд А емкостью 0,5 л,нуда налито 150 мл смеси хлороформ-бензол (1:2,5 ), содержащей 0,15 мл поверхностно-активноо вещества (полиоксиэтиленсорбитанмоноолеатТвин). В сосуд опускают мешалку и смесь эиульгируют 5 мин при 440 об/ /мин. После окончания эмульгирования 10 смесь выпускают через нижний отросток сосуда А непосредственно в регенери" рующий раствор ( 400 мл ацетона и 24 мл концентрированной серной кислоты ), на-. литый в сосуд Б, Через 10 мин жид" 1 кость сливают, а образовавшиеся шарики отмывают" 1 О объемами воды. Продукт фракционируют путем оседания в цилиндре и отделяют фракции, содержащие частицы размером 100"280 мк. , 20Активирование -носителя. К 1 г от" мытых целлюлозных пористых шариков добавляют 100 мл 0,2 М На 30,1. Реакционную смесь слегка перемешивают 30 мин прй комнатной температуре в темноте. 2 З Окисленные шарики промывают на воронке Бюхнера 200 мл воды и хранят в воде. Окисленный продукт остается активным и может быть использован по крайней мере в течение 6 мес. эр9 8Сочетание с белком. 1 г активированных целлюлозных пористых шариков промывают на воронке Бюхнера 200 мл 0,1 М карбонат-бикарбонатного буфера рН 9,0 и добавляют к ним в разных случаях 25,100 или 400 мг белка, раст,воренного в 1 О мл этого же буфера. ля соивтания использовали иммуногло булин у кролика,. Гмесь оставляют на 16-18 ч при 4 оС. После окончания сочетания избыток жидкости удаляют на воронке Бюхнера и препарат промывают 1 объемом 0,85-ного раствора МаС, Затем к осадку для восстановления добавляют 100 мл 0,2 М МаВН, в 0,853-ном растворе 14 аСУ. Восстановление проводят в течение 1 ч при комнатной температуре. Препарат последовательно отмывают 500 мл 0,853-ного раствора йаСУ-, 100 мл 0,01 н, НСУ, содержащей 0,853-ной йаС У и 200 мл 0,85" -ной МаГУ, Полученный иммуносорбент хранят в 0,85 Ф-ном растворе ,МаСУ при 4 С. При необходимости длиотельного хранения к нему добавляют мертиолят до концентрации 1:10000.968039 1 С 4 1 3 1 Х ХХ с О 1 О аа Э 1 1 1- С й 3 О У 11 С 1 дехос О.О Х О ооэ ах со О 1 О.Сй 3 . Х К В ОСЧ 1 о% Ххм 111 1 1 1 3 1 1 Щ о 1- Х 333 1 ;, аО ЕС 1 1 Э 1О. 1 - с 1 11 1 1 1 1 1 1 1оХ 333Э Х1 У1 Э 11 33 й1 й 32 оС о с л лОС 0 о 1 - 3.1 3 й 1 ф 1 0 3-1 1 а Х 1 Х л 3 О д 1 х О:т Э Х 1 Э 1- Хцзо3- Св хо 1 Х 333 Х 1 1 1- 1а Х 1 Й ОКОЕо 1- 3 О Х Х 1 Э Х Эа ХЗО лл чь л о о о 1 1 1 1 11 3 1 1 1 1 1 1 111 1 1 1 1 1 1.3 3 3 3 1 1 1 1 1 11 3 1 о оь л М О 1 О -Ф 1 м щ1 313 9680характеристика синтезированных иммуносорбентов, В табл. 1 приведены сравнительные данные свойств иммуносорбентов в виде известной суспензии и предлагаемых иммуносорбентов на ос- ю нове пористых целлюлозных шариков.Результаты колоночных опытов с иммуносорбентами на основе пористых целлюлозных шариков приведены в табл.2.Как . видно, из приведенных данных, 10 синтезированные иммуносорбенты по емкости не уступают иммуносорбенту на основе суспензии целлюлозы и способы присоединять от 250 до 1000 мг антител на 1 г сорбента. Однако, в отли- О чие от известного, иммуносорбент на основе пористых целлюлозныхшариков способен хорошо пропускать ток жидкости, что делает его пригодным для использования в хроматограйических 20 колонках.Использование предлагаемого способа получения иммуносорбента на основе пористых целлюлозных шариков имеет следующие преимущества: 25основа для приготовления иммуносорбента готовится из дешевого сырьяцеллюлозы );основа для иммуносорбента может выпускаться в активированном состоя- Зв нии и хранится многими месяцами;приготовление иммуносорбента на основе хранящихся целлюлозных шариков очень облегчено, т.е. потребителю достаточно добавить необходимый белок 39 14( антиген или антитела ) и восстановить препарат;препараты иммуносорбентов обладают большой емкостью и не уступают в этом отношении известному, они могут хорошо пропускать ток жидкости, благодаря чему их можно использоватьхроматограйических колонках.Предлагаемый иммуносорбент может найти широкое применение в,биомедицинской технологии.формула изобретенияСпособ получения сорбента на основе целлюлозы, включающий переосаждение целлюлозы из ее медно-аммиачного раствора с последующими активацией и коньюгацией с,белком, а т л и ч а ющ и й с я тем, что, с целью получения высокоемкого препарата, способного пропускать ток жидкости, 0,5-6,04- ный раствор целлюлозы, эмульгированный в смеси бензола и хлороформа при их соотношении 1:2;5 в присутствии 0,1-0,й полиэтиленсорбитанмоноолеата, переосаждают введением в М-ный раствор серной кислоты в ацетоне.Источники информации,принятые во внимание при экспертизе1. Гурвич А.Е. и др. Биохимия, М.,1961, с. т, 26, с. 934 (прототип),"Патент", г, Ужгород, ул, 41 д. 4/5тити евроектная,Реаакторри Г, ВолковащвЪГщЕЬфщщащ вввещЗаказ 802 Ь/38ВНИИПИпо де113035 МтевитеитвЬЕСиФилиал ППП кая Кдрректор С. Векма Подписное