Способ выращивания средиземноморской мидии

(19) (11) ф(51) А 01 К 61/00 ЗОБРЕТЕНИДЕТЕЛЬСТВУ СА РСНОМУ СВ вател в Г978.Макларищевая4-286.СРЕДИЗЕМ фр Фиг ГОСУДАРСТ 8 ЕННЦЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЦТИЙ(71) Азовский научно-исследокий институт рцбного хозяйст(56) 1. Патент СБА Мф 4080930кл. А 01 К 61/00, опублик. 12. Бардач Д., Ритер Д, ини У. Аквакультура, М., "Нпромьш 1 ленность", 1928, с. 28,(54)(57) СПОСОБ ВЫРАЩИВАНИЯИОМОРСКОЙ МИДИИ Муй 1 пз ес 1 ц 1 яа 11 оргочдпса 1 хз, предусматривающийнерест производителей, установку вместах нереста субстратов для оседания личинок и дальнейшее подращивание осевших личинок на .субстратах,Фо т л и ч а ю щ и й с я тем, что,с целью повышения выхода товарнойпродукции мидий, перед нерестом осуществляют подбор родительских понуляцнй или особей для скрещивания ихпо фенотипу эстеразы гепатопанкреаса, при этом подбор проводят так,чтобы получить 50-1003 молоди сгетероэиготным фенотипом, Ъ 1 1161Изобретение относится к аквакультуре, а именно к способам выращивания.средиземноморской мидии (Иу 1 ь 1 пзедц 11 з яаПоркоч 1 пс 1 а 11 з) и можетбыть использовано в мидийных хозяйствахеИзвестен способ выращивания двустворчатых моллюсков-мидий, согласнокоторому молодь, полученную посленереста, выращивают в Искусственных 16условиях до желаемых размеров, осуществляя кормление ее водорослями,задаваемыми в высоких концентрациях Я ,Известный способ позволяет уско- црить темп роста мидий, однако приэтом требуются затраты на получениеводорослей,Наиболее близким к предлагаемомупо технической сущности и достигаемому результату является способ выра .щивания средиземноморской мидии,предусматривающий нерест производите.лей, установку в местах нереста суб"стратов для оседания личинок и даль- рнейшее подращивание осевших личинокна субстрате. При осуществлении данного способа субстраты а осевшеймолодью переносят в условия , наиболее благоприятные для роста мидий 12.Однако данный способ не обеспечивает селективного повышения такиххозяйственно важных качеств выращиваемых мидий как темп роста и выживаемость выход продукции мидий полФ33костью зависит от температурных и по"годных условий.Цель изобретения - повышение выходатоварной продукции мидий.Поставленная цель достигается тем,что согласно способу выращивания средиземноморской мидии (Иус 11 цз ейц 1 хзда 11 оргоч 1 пс 1 а 1 з), предусматривающему нерест производителей, установкув местах нереста субстратов для оседания личинок и дальнейшее подращивание осевших личинок на субстратах,перед нерестом осуществляют подборродительских популяций или особей дляскрещивания их по фенотипу эстеразыгенатопанкреаса, при этом подборосуществляют так, чтобы получить 5010 ОЖ молоди с гетероэиготным Фенотипом.На фиг.1 изображены три фенотипа З 5зстеразного локуса, полученные приэлектрофорезе эстераз гепатопанкреасамидий (АА и ВВ - гомозиготы, АВ -045 2 гетероэиготы); на Фиг.2 - рост степени гетерозиготности с увеличением веса мидий (по оси ординат - . гетеразигот, по оси абсцисс - весовые классы, вес. в мг,). Каждый столбец диаграммы показывает Х гетерозигот всоответствующем весовом классе, наФнг.3 - рост степени гетероэнготностис возрастом мидий,Сущность способа заключается виспользовании явления гетерозиса потемпу роста и выживаемости средиземноморской мидии, маркированного эстераэным локусом, Явление гетерозисаобнаружено при исследовании природныхпопуляций средиземноморской мидии населяющей Азовское море. У мидий одного возраста, взятых в Азовском мореиз Обиточного залина (100 экземпляров, сеголетки), Каэантипского залива (50 экземпляров, 2 г), Железинской Банки (50 экземпляров, 2 г),взвешивали мягкие ткани, а затем выделяли гепатопанкреас. Гепатопанкреас гомогенизировалн с добавлением40 . раствора сахароэы в соотношении1:1. Гомогенат центрифугировали. Надосадочную жидкость подвергали дискэлектрофорезу в блоке 10 полиакриламидного геля (концентрирующий гель4 , рН 6,7, разделяющий гель 10 , рН8,7, электродный буферный растворрН 8,3, ток 25 мА/см),По окончании злектрофореза гелевыйблок для выявления зон активностинеспецифических эстераз (ферменты,гидролиэующие эфирную связь карбоновых кислот с нафтолом) помещали в,инкубационную смесь состава 97 мл0,05 М Трис-НС 1 буферного растворарН 7,1+3 мл 1 -го раствора И-нафтилацетата + 100 мг прочного, синего РРсоли. Инкубацию проводили в темнотепри 37 С до появления коричневогоокрашивания в зонах локализации Фермента. В средней зоне полученных Фюреграмм обнаружено три феиотипа( Фиг.1.). Подвижность компонентовА и В составляет соответственно 0,67и 0,63. Образование двух гомоэнготных(АВ) фенотипов контролируется по типу однолокусной диаллельной системы,Весовые значения мягких тканей мидий ранжировали и разбили на 4-5 классов в каждой выборке. Получили кривыераспределеиия веса тканей в.выборках, которые подчиняются нормальному зако.ну. Затем анализировали степеньгетероэиготности по эстеразному локусу в каждом весовом классе. Обнаружено четкое повышение гетерозиготностис увеличением веса тканей мидий во 5всех выборках (фиг.2). Коэффициентыкорреляции для выборок иэ Обиточногозалива, Казантипского залива, Железинской банки соответственно составляет 0,99 (р : 0,001) 0,90 (р : 100,01) и 0,86 (р.= 0,01). Расчетсредневзвешенных весовых значенийпоказал, что вес мягких тканей умидий с гетерозиготным Фенотнпомвыше у сеголеток на 20,57, а у двухлеток на 107., чем у мидий с гомозиготными Фенотипами; Сопоставлениедолей гетерозиготных фенотипов уразновозрастных мидий показалодостоверные их различия. У более 20взрослых мидий доля гетерозигот выше, чем у молодых Форм. Различияв доле гетерозиготных Фенотипов эстеразного локуса у мидии Азовского морясоставляет от 28 Х для двухлетнего 25до 523 для четырехлетнего возраста(Фиг.З).Увеличение доли гетерозигот свозрастом соответствуеу их большейвыживаемости (на 307), чем мидий сгомозиготными Фенотипами. Кроме того, исследования природных популяцийа также выборок, взятых с корреляторов мидийного хозяйства, показали,что доля гетерозиготных Фенотипов умолоди мидий не превышает 307.Приведенные результаты исследования природных популяций средиземноморской мидии, населяющих Азовскоеморе, свидетельствуют о том, что ми-дии с гетерозиготным фенотипом поэстераэному локусу (АВ) обладаютболее высоким темпом роста (на 10,а их выживаемость на 307 больше,чем мидии с гемоэиготными фенотипами 5АА и ВВ),Способ осуществляют следующимобразом.Молодь мидий с долей гетерозиготных фенотипов эстеразного локуса 503 50получают путем подбора природных. популяций для скрещивания из разных. мест обитания, Генетический контрольпри.подборе популяций и получаемогопотомства осуществляют методом диск" М,электрофореза в 107. полиакриламидногогеля эстераз гепатопанкреаса. Расчетожидаемого соотношения фенотнпов у получаемой молоди производят с помощью уравнения Харди-Вайнберга,согласно которому при обозначениичастоты аллелей эстеразного локусав популяции мидий А и В через р и ксоответственно, первое поколениемолоди от этой популяции имеет следующее сочетание Фенотипов. Р (АА) + 2(АВ) + кф (ВВ),Частоты аллелей выражаются в доляхединицы, при этом сумма частот равнаединице, Для вычисления частоты аллеля к числу особей гомозиготных поданному аллелю прибавляют 1/2 числагетерозиготных фенотипов и полученную сумму делят на объем выборки.При выборке 100 мидий со следующимсоотношением Фенотипов 5 (АА) + 10 (АВ)(А) (5+10:2)/100 0,1 и для другого аллеля 1 с (В) = (85+10:2)100 == 0,9. Соотношение Фенотипов в первомпоколении при скрещивании внутри популяции, используя уравнение ХардиВайнберга, имеет следующий вид0,01 (АА) + 0,18 (АВ) + 0,81 (ВВ),17 (АА) + 187 (АВ) + 813 (ВВ).Подбор популяций проводят так,чтобы у вновь образованной родительской популяции соотношение частоталлелей было равно 1;1 или близкоек нему. Такое соотношение аллелейв родительской популяции необходимодля получения 503 особей мидий сгетерозиготным Фенотипом. Это вытекает из уравнения Харди-,Вайнберга,иэ которого доля гетерозигот в одном поколении равна удвоенному произведению частот аллелей (2 Р% ). Следовательно, если в результате подбора популяций получают значения частот аллелей р (А) и Ъ (В) равные 0,5и 0,5 соответственно, то доля гетерозигот у получаемой молоди мидийравна 2 х 0,5 х 0,50,5 или 503.Иолодь,мидий с 1003 гетерозиготностью по эстеразному локусу полу-.чают путем подбора родительских пардля скрещивания, используя законрасщепления признаков Г. Иенпеля.При этом руководствуются следующейсхемой скрещивания11610П р и м е р 1, Предварительно исследуют природные популяции с цельюобнаружения необходимых сочетанийв них фенотипов и частот аллелейэстеразного локуса, Для этого в различных местах обитания отбирают мидий не менее 100 экземпляров в каждой выборке. У мидий выделяют гепатопанкреас, гомогенизируют его с добавлением 40% раствора сахарозы в 1 бсоотношении 1: 1, гомогенат центрифугируют, Надосадочную жидкость подвергают электрофорезу.в 107 полиакриламидном геле (концентрирующийгель 4%, рН 6,7; разделяющий гель107., рН 8,7," электродный буфер рН 8,3ток 25 мАс), По окончании элекгроФореза гелевый блок для выявленияэстеразной активности помещают в ин:.убационную смесь следующего соста- Ива: 97 мл. 0,05 И Тряс-НС 1 буферарН 7,1-3 мл 17-ного раствора Ы-нафтилацетата + 100 мг прочного синегоРР соли, После окрашивания фореграмманализируют соотношение гомозиготныхи гетерозиготных Фенотипов и частотыаллелей в каждой выборке. Обнаруженоследующее соотношение Фенотипов5 (АА) + 10 (АВ) + 85 (ВВ) с частота.ми аллелей р(А) = 0,1, В) = 0,9. ЗОДоля гетерозигот в первом поколенииот этой популяции составляет 18%(из уравнения Харди-Вайнберга долягетерозигот равна удвоенному произведению частот аллелей, 2 р 1), Анализздругих мест обитания мидий показал,что существует популяция с соотношением фенотипов (64 (АА)+32(АВ)+4(ВВ)и частотами аллелей р (А) = 0,8,1 (В) = 0,2. Рассчитывают доли Фено- цтипов, которые получаются при скрещивании равных долей двух популяциймидий, В результате смешения двухравных долей популяций мидий дляскрещивания доли Фенотипов составляет 34,5(АА) + 21(АВ) + 44,5(ВВ), ачастоты аллелей р (А) = 0,45 и 1 (В)= 0,55, что показывает простой расчет средних, Из уравнения ХардиВайнберга (р + 2 р +) рассчиты- рвают соотношение фенотипов у молодиФв первом поколении, оно равно20(АА) + 49(АЗ) + 31(ВВ), Таким образом, в результате подбора популяций для скрещивания можно увеличить удолю получаемой молоди мидий с гетерозиготным Фенотипом эстеразного локуса с 18 до 49%. Для этого с помощью мидийной драги производятотлов мидий донорской популяции счастотами аллелей р(А) = 0,8 и1 (В) = 0,2. Выловленных мидий распределяют равномерно в соотношении1:1 среди популяции, обитающей в районе хозяйства. Отлов и подселениедонорской популяции проводят донаступления массового нереста мидий,в это же время устанавливают субстраты, на которых происходит оседаниемолоди. После нереста и оседаниямидий полученный шпат (осевшая молодь) содержал 49-50% мидий с гетеро.зиготным Фенотипом эстеразного локуса. Параллельно проводилось наблюдение за контрольной группой мидий изпопуляции, обитающей в районе хозяйства.Сравнение результатов выращиваниядвух групп мидий по 1000 экземпляровв каждой группе показало, что в первой группе (контроль) доля гетерозигот составляет 187., во второй 507,.Так как естественная смертность выращиваемых мидий зависит от условиИокружающей среды, то эффективностьприменения предложенного способа различна,Данные по выращиванию этих группприведены в табл,1.Вследствие того, что выживаемость гетерозиготных Фенотипов на 30% выше, а их темп роста на 207. больше, чем у мидий с гомознготными .Фенотипами, по окончании выращивания получают соответственно и долю мидий с гетерозиготными фенотипами больше на 307., а средний вес особей с гетерознготными Фенотипами больше на 207, чем гомозиготкых особей.Из табл.1 видно, что в благоприятных условиях выращивания (выживаемость гетерозигот 100%, гомозигот 707), выход товарной мидии на 21% больше при увеличении доли гетерознгот с 18% до 507В табл, 2 приведены данные по выращиванию таких же двух групп мидий по 1000 экземпляров в каждой. Как видно из табл. 2 в случае снижения выживаемости выращиваемых мидий (гетерозигот 507., гомозигот 20%), что является следствием неблагоприятных условий,. эффективность предложенного способа выращивания возрастает до 47%.Таким образом, повышение гетерозиготности по эстеразному локусу мидий с 18 до 50% позволяет увеличить выход товарной мидии в эавИсимости от условий среды на 21-477.П р и м е р 2. Получение 100% мо. лоди мидий с гетерозиготным фенотипом эстеразного локуса (АВ) начинают с выращивания г 6 мозиготных линий (АА) и (ВВ). Для этого каждую пару 10 половозрелых мидий (самец + самка) высаживают в отдельные садки, где происходит их нерест и оседание молоди на субстратах. После получения молоди родительские особи. анали эируют с помощью диск-электрофореза ,эстераз гепатопанкреаса в 10% полиакриламидного геле (по примеру 1). Анализ показал, чтопри скрещивании в садках возникают следующие сочета ния родительских пар по фенотипу зстеразы АА х ВВ; АА х АВ; ВВ х АВ; АВ х АВ; АА х АА; ВВ х ВВ. Соотношения фенотипов у полученной молоди от этих сочетаний в соответствии с законом расщепления признаков Менделя будут1. АА х ВВ = 1007. АВ2, АА х АВ - "50% АА + 507. АВ3. ВВ х АВ = 507 ВВ + 50% АВ ЗО4. АВ х АВ = 25% АА + 50% АВ+ 25% ВВ5. АА х АА = 1007. АА6. ВВ х ВВ = 100% ВВМолодь мидий, полученную в садках от скрещивания по вариантам 1-4, вы ращивают до желаемого размера и реализуют. В садках с вариантами 5 и 6 получены гомозиготные линии мидий (АА) и (ВВ). Мидии гомозиготных линий с наступлением у них половой зрелос-. щ ти используют для получения молоди с долей гетерозиготных фенотипов 100%, Для этого подбирают родительские особи по следующей схеме1. Самки (АА) х самцы (ВВ) = 5100% АВ2, Самцы (АА) х самки (ВВ) - 100% АВПодобранные таким образом родительские особи помещают в садки, где происходи их нерест и оседание молоди на субстратах. Затем осевшую молодь выращивают до желаемого размера.Для сравнения результатов выращивали две группы мидий по 1000 экземпляров в каждой. В первой группе доля гетерозигот составляет 18%, во второй 1007В табл. 3 приведены результаты чыращивания при условии выживаемости мидий с. гетерозиготными фенотипами 100%, с гомоэиготнымн 70% (с учетом того факта, что выживаемость гетерозиготных фенотипов на 30% выше, а их темп роста на 20% выше, чем у мидий с гомозиготным фенотипом).В табл. 4 приведены результаты выращивания таких же двух групп мидий по 1000 экземпляров в каждой, но при выживаемости гетерозиготных особей 5%, а гомозиготных - 20%.Из табл. 3 и 4 следует, что увеличение доли гетерозиготных фенотипов у мидий с 18 до 100% позволяет повысить эффективность их выращивания на 50-120%. Различия в эффективности выращивания зависят от условий выращивания, т,е. от смертности мидий в процессе их роста на субстратах.Применение предложенного способа выращивания, направленного на подбор популяций и отдельных особей мидий для скрещивания позволяет увеличить долю гетерозигот эстеразного локуса до 50-100%, которые обладают большим, темпом роста на 20%, а выживаемостьих на 30% вьппе, чем у гомоэигот, Чем хуже условия, в которые попадает выращиваемая мидия, чем выше эффективность предъявляемого способа. Таким образом, повышение гетерозиготности выращиваемых мидий на 50-100% обеспечивает увеличение продуктивности при промьппленном выращивании мидий на мидийных хозяйствах 20-120% или в оеднем на 707Экономический .эффект от примененияпредложенного способа составляет11200 руб. в г, с 1 га.Конец выращивания Группа ачало выращивания Выход,ХОбщийвес Число мидий с Фенотипом Средний вес одной мидии с Фенотипом испо мидий с Фенотипом АА, ВВ АВ,АА, ВВ АВ АА, ВВ АВ 1 187.1 г 500 350 950 г 1213 1,2 г 500 Таблица 2 Группа Начало выращивания Конец выращивания Средний вес одной мидии с фенотипомАВ АА,ВВ исло мидий Фенотипов Число мидий с фенотипом Общийвес Выход, 7 АВ АА,ВВ АА,ВВ 12 г 1 г 90 164 272 г 1003 180 820 1,2 г 1 г 250 100 400 г 1473 500 500 Таблица 3 Конец выращивания Группа чало выращивания Общ " Выход,вес Х исло мидий фенотипом Средний вес одной мидии с фенотипом о мидий с фенотипом АА,ВВ ВВ А 118 Ж (АВ) 1,2 г 1 2 180 37. 00 г 0 не 1,2 г нет ож ЬВ 1 00 нет У 1183 (АВ)Иф 2503 (АВ) 1 1 0 570 786 г 101161045 Составитель С Техред Т.Фант иппова едактор Н. Волови Демчи оррект аз 3874/б дписноР илиал ППП "Патент", г. Ужгородул, Проектная Тираж НИИПИ Госуда по делам из 13035, Москв 43твенногоретенийЖ, Р митета Сткрытийская наб