Способ выращивания микроорганизмов

Всесокзэная 0 П И-СРНЧй ИЗОБРЕТЕНИЯ Сфвз Соеетскик Социалистических Республик(3) 530422 (33) СНА Государственный комитет СССР по делам изобретений и открытий(72) Авто ыИностранцы -1 Дональд Оливер Хитцмэн и Юджин Герман Вегнеризобретейия(США) Иностранная фирма фФиллипс Петролеум Компаниф( 54) СПОСОБ ВЫРАЩИВАНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ Изобретение относится к способамвыращивания микроорганизмов, преимущественно бактерий и дрожжей, на питатеяьной среде, содержащей спирт,как основной источник углерода,Современная нехватка продовольствия во всем мире вынуждает исследовать и разрабатывать методы производства высококачественйых недорогостоящих,белков, продуцируемых микроорганизмами, например белков, продуцируе-мых одноклеточными организмами, чтобы таким образом разрешить возникшуюпроблему. В таких процессах ферментации большое значение имеют разработки по использованию углеводородови других углеродосодержащих веществ,которые обычно сжигают или иным образом устраняют при очистке нефти.В качестве основного источника углерода особенно привлекает использование метанола. Метанол смешиваетсяс водой и может быть получен иэ разнообразных углеводородных веществлегко и без больших затрат в любойчасти мира, где имеется любая Формаинфузорной земли. Кроме того, метанол характеризуется отсутствием потенциально" канцерогенных полицикличных углеводородов и т, д,1/ Известен способ выращивания микро-.организмов в условиях аэрации кислородосодержащим газом питательной среды, содержащей прямоцепочные алифатические спирты с 1-16 атомами углерода в молекуле в казачестве,источникауглерода, источник азота и необходимые минеральные соли, Ц .Целью изобретения является интенсификация процесса.Это достигается тем, что в предлагаемом способе выращивания микроорганизмов аэрирование среды осуществляют так, что в процессе ферментациипитательную среду с микроорганизмамиподдерживают в виде пены с циркуляцией ее в процессе ферментации,Изобретение можно рассматриватькак процесс аэробной Ферментации источника углерода, который усваивается микроорганизмами в ферментерах,заполненных пеной, Источником углерода является спирт, который усваивается соответствующим микроорганизмОмдля продуцирования микробиальных клеток, которые можно использовать в качестве источннка пищи (белки, образующиеся в одноклеточных оганизмах).Обнаружено, что ферментация в Фермен-.терах, заполненных пеной, в случае7 ОбО 26 Соответствующие микроорганизмыможно выбрать иэ бактерий, дрожжейи грибков. Можно использовать дрожживидов Сапд 1 йа, Напяепцба, ТогцСорз 1 в,ЯассаЬагошусев, Р 1 сЬ 1 а,. ОеЬагуошусевЬ 1 рошусез, Сгур 1 ососсцв, Неша 1 оярогаи Вгеазапошусея.,Предйочтительнее использовать дрожжи разновидностей Сапй 1 йа, Напяепцба,:Тогцборя 1 з, Р 1 сЬ 1 а,и Яассйагошцсев.3гКроме того используются виды дрржжей:Сапй 1 йа Ьо 1 й 1 п 11СапйЫа шусодегшаСапйЫа ц 1111 зСапй 1 йа в 1 е Иа 1 о 1 йеаСапй 1 йа гоЬця 1 аСапй 1 йа с Сацвзеп 11Сапй 1 йа гипнозаВгеб 1 апошусез ре 1 горЬ 111 цш 35 40 50 Напепиба ш 1 пцкаНапвепц 1 а вакцгпцвНапзепцВа са 61 когп 1 саНапвепцба шга)с 11"НапвейцВа яНчз.соГаНапзепцба робушогрЬаНапяепц 1 а ч 1 с)сегЬаш 11Напвепиба саряц 8 а 1 аНапвепцба ц 6 исовушаНапзепцба пепг 1 с 11Нап вепц 1 а поп Г е вше пса пвЙапяепи 1 а рЬ 11 одепс 1 ка 55 непрерывного процесса высоко эФфективна. Содержание пены в Ферментереможно описать как дисперсию газообразной Фазы в жидкой Фазе, как эмульгированную гаэообраэную фазу или просто, как эмульсию газовой или жидкойфазы, где увеличенная поверхностьмежду газовой и жидкой Фазами усиливает процесс Ферментации,Способ осуществляют следующим образом. ,.1 0Процесс Ферментации проводят на пи-тательной среде, содержащей алиФатические спирты с прямой цепочкой, имеющие от 1 до 1 б атомов углерода намолекулу, которые обеспечивают углерод и энергию для роста микроорганиэмов. Спирт имеет от 1 до б атомов углерода на молекулу, предпочтительноиспольэовать этанол или метанол и более предпочтительно - метанол.20В качестве спиртов используют метанол, этанол, 1-пропанол, 1-бутанол,1-октанол, 1-додеканол, 1-гексадеканол, 2-пропанол, 2-бутанол и 2-гекса:нол. При необходимости можно такжеиспользовать смеси этих спиртов.В процессе Ферментации микроорганизмы способны усваивать один или бо,лее укаэаннйх спиртов в качестве источника углерода и энергии при ихросте или развитии. 30сапд 1 даЬоЕш 11уеква 1161 вдбаЬгак,ашоИвЬ 1 апапешодепйгап 11 га орЬ 10 ар 1 пцв Р 1 сМа Р 1 сЬ 1 а Р 1 сМа Р 1 сЬ 1 а Р 1 сЬ 1 а Р 1 сЬ 1 а йаг 1 поваробушогрЬап 1 ешЬгапаейас 1 епвр 1 пцзрав 1 ог 1 екгейаборЬЮа ЯассЬагошусез ЯассЬагошусев ЯассЬагошусея ЯассЬагошусея ЯассЬагошусев ЯассЬагошусев ЯассЬагошусев Яассйагошусез Используются бактерии видаВас 1 йив, МусоЬас 1 ег 1 цш,АсЫпоШусев, Иосагй 1 а, Рвецйошопав, Ме 1 Ьапошопаз, Ргокаш 1 по.Ьасег, МеЖЬуососсцв, Вгеч 1 ЬасТег 1 цш, Асе 1 оЬас 1 ег, М 1 сгососсцв, ВЬойорзецйо. шопаз, СогупеЪасСег 1 цш, ЙЬойорвеийо ,шопав, М 1 сгоЬасСег 1 цш, АсИгошоЬаскег. ИеЬубоЬас 1 ег, Мекпубоз 1 пця и МеЮуВосув 1 в ., Предпочтительнее испольэование 7 1 бактерий разновидности Вас 11 цв, Рвеийошопав, Рго 1 аш 1 поЬас 1 ег, ЮСгососсив, АгСЬгоЬаскег и СогупеЬас 1 ег 1 цшИспользуются виды бактерий:Вас 1 ЕЕцв яцЬИцвВас 1 Ицв сегецвВас 1 Ицв ацгецзВас 1 Ицв ас 1 й 1Вас 1 Иця цг 1 с 1Вас 1 Ицз соадцбапвВас 1 Ицз шусоЫезВас 1 Ыцв с 1 гсцбапвВас 1 Иця шеда 1 ег 1 цшВас 1 66 цз 61 сЬеп 1 йогш 1 яшеЫайо ИсаИдивСг 1огч 1 Иашекпап 1 саИцогевсепзаегцц 1 поваоСеочогапврц 11 йаЬогеороИзруосуапеашеИьуСрЬ 16 цзЬгеч 1 вас 1 йочогапяшеЮапоЕох 1 даиаегодепез Рвецйошопав Ряецйошопав Рвецйошопая Рвецйопюпав Ряецйошопаз Рвецйопюпав Рзецйсшопав Рвецйошопав Рвецйошопав Рвецйошопаз Рвецйошопав Ряецйошопав Рвецйошопаз Рзецйошопав Рвецйойопав Токиборв 1 я Токи боря 1 я Тогиборз 1 в Тогцборе 1 в Тогцборя 1 в Тогц 5 оря 1 в Тогцборз 1 я Токцорв 1 в сегеч 1 в 1 ае .Егад 111 ягове 1асЫ 1 йас 1 епвейецапегоцх 11бас 11 вйгас 1 цш .НЬ 1 хорцв НМгорця ВЬ 1 яорцв ВЬ 1 яорця НЬ 1 яорця п 1 дг 1 сапвогухаейе хетагаггЬ 1 гцяяоВоп 1 йег СогупеЬас 1 ег 1 цв СогупеЬас 1 ег 1 цщ СогупеЬасхег 1 цв СогупеЬасег 1 ит СогупеЬасг,ег 1 цв СогупеЬасх,ег 1 щп СогупеЬасхег 1 щп СогупеЬасхег 1 цв СогупеЬас 1 ег 1 цщ в 1 щрВехЬуйгосагЪоохуйапвах,)сапцщоВеорЬ 1 ВияЬуйгосагЬосВавхцвдбцащ 1 сцщч 1 всовцяй 1 охуйапваВ)сапцв Мцсог вцсейоМцсог депечепя 1 я. 20 30 ДгсЬговоЬасхег соадцбапя ЩВгеч 1 Ьасхег 1 щп ЬШап 1 сцвВгеч 1 Ьасхег 1 цв говецвВгеч 1 Ьас 1 ег 1 цв ИачцвВгеч 1 Ьасхег 1 ив ВасхойегщепхшпВгеч 1 Ьас 1 ег 1 цв рагайЕ 1 поВуЫсищ . 45Вгеч 1 Ьас 1 ег 1 цв Ее 1 одВ ц 1 ащ 1 сцтВгеч 1 Ьасхег 1 цв хпвесЫрЬ 1 В 1 шп;Применяютсягрибки иэ рода Аярегд 1 В-Вця, Моп 1 В 1 а, Ипгорця, Реп 1 с 1 ВВ 1 цв,МцсоГ, А 1 егйаг 1 а и НеВв 1 пхповрог 1 шп, 50 пох.ащпсЬгуяодепцвд Вацсцвдг 1 яеойцВчцщехрапяцвй 1 д 1 хаХцщ1 а В 1 сщп Реп 1 с 1 ВВ 1 цщ Реп 1 с 1 6 В 1 цщ Реп 1 с 1 ЕВ 1 цв Реп 1 с 1 ВВ 1 щп Реп 1 с 1 ВВ 1 цв Реп 1 с 1 ВВ 1 цв Реп 1 с 1 ЕВ 1 щп Рго 1 ав 1 поЬасхег гцЬег М 1 сгососсия сег 121 сапвМ 1 сгососсцв гЬой 1 цв,АгЮгоЬасхег гцйевсепвАгхпгоЬасСег рага И 1 сцщАг 1 ЬгоЬасхег в 1 врВехАг 1 ЬгоЬасхег с 1 хгецв ИеВЬаповопав веЮап 1 саМе 1 Ьапощопая щеЖапоох 1 йапв МеЖубощопав . ад 1 ВеМеЮуВовопав а 6 ЬияМе 1 ЬуВовопйз гцЬгапМехпубовопав ще 1 Ьапо 61 са ИусоЬас 1 ег 1 шп хйойосЬгоцв 1МусоЬасхег 1 цв рпВе 1МусоЬасСег 1 цв Ьгеч 1 саВе Носагй 1 а яабвоп 1 собогИосагй 1 а в 1 п 1 вцвМосагй 1 а сога ВВ 1 паЙосагй 1 а Ъихап 1 са Иьойоряецйощопая сарвцВайця М 1 сгоЬас 1 ег 1 щп атвоп 1 арЬ 1 Вшп Примеры испольэуемых видов грибков;Аврегд 1 ВВив п 1 дегАврегд 1 Иив дВацсцв;Аярегд 1 ВВцв хВачияАврегд 1 ВВцв хеггеияАярегд 1 ВВцв 1 хсоп 1 сцв На рост микроорганизмов окаэывает влияние температура ферментера икаждый отдельный вид микроорганизмаимеет оптимальную температуру дляроста. Выращивание вфермейтере проводят при 30 и 65 С, предпочтительномежду 35 и 60 фС. Температура эависитот испольэуемых в процессе Ферментации вдов микроорганизмов, так какони будут иметь некоторое различиев соотношении температура/скоростьроста.Соответствующую питательную средуподают в ферментер для обеспеченийпитательных веществ, таких как усваиваемый источник азота, фосфора, магния, кальция, калия, серы и натрия, 5 так же. как следй меди, марганца, молибдена, цинка, желеэа, бора, иода иселена, при этом количество питательных веществ изменяют в эависимостмот выбранного дпя процесса вида микроорганизма, Питательная среда можеттакже содержать, витамины, присутствиекоторых желательно для .раэвития определенных видов микрооргакиэмов. Мно;гие из дрожжей требуют наличия одного или двух витаминов, например био-тин и тиамин.Состав питательной срехпю на 1 л водного раствора:НРО 4(85)2 0 мпКСВ 1,0 гМдБО 4. 7 Н О 1,5 гСаСВ2 НО0 2 гЫаСВ 0,1 гРаствор неорганическйх соединений - 5,0 мл .Раствор неорганических соединенийв ниде следов имеет следующий состав,г/л:СцБО 4 5 Н О " -0,06КВ 0,08ГеСВ6 НО 4,80МпБО 4 НхО 0,30ИаВМо 04 2 Н О 0,202 пБО, 7 Н ОЕ2,00НАВОЗ 002.При использовании проведенной питательной среды источник усваиваемого аэота обеспечивают раэдельным добавлением водного раствора аммиака(ИН 4 ОН) в ферментер. Количество добавки БН 4 ОН зависит от рН требуемогодля данной реакционной смеси, котороебеэ добавления БН,ОН рН равно, примерно, 2 для питательной среды. Прииспольэовании в процессах ферментации 5 дрожжей или грибков рН равно, примерно, 3-5, а при использовании бактерий рН равно 6-7,5,ферментация представляет собойаэробный процесс, в котором кислород,необходимый для йроцесса, получаютиз источника, содержащего кислород, 5например из воздуха, который подаютв емкость для ферментации при давлении, приблизительно от 1 до 100 атм.и, предйочтительно,от 1 до 10 атм,Хорошим источником кислорода является воздух,обогащенный кислородом.На реакцйю ферментации часто благоприятно действует применение давленияв вЫшеуказанной области и в предпочтительных пределах.15ферментацию проводят непрерывноили периодически. В непрерывном илипериодическом процессе ферментер вначале стерилизуют, а затем его засевают-культурой микроорганизма при наличии всех необходимых питательных веществ, включая кислород и источникуглерода, При непрерывном процессеисточник кислорода или воздух подаютнепрерывновместе с непрерывным вводом питательной среды, источника азота (если он добавляется отдельно) испйрта с расходом, который или предварительно задают, или задают в соот"ветствии с требованием регулированиятаких параметров, как концентрация 130спйрта, степень растворения кислоро" да; концентрация кислорода или двуокиси углерода, в газах, выходящихиз ферментера. Скорость подачи различных веществ изменяют так, чтобы . 85при эффективйом использованииспиртаполучить как быстрый рост микроорганизмов, так и возможную консистенцию,т, е, высокий весовой выход микроорга.низмов на вес загружаемого спирта. 40Скорость подачи спирта является важной переменной величиной, подлежащейрегулированию, так как высокая кон-" "центрация спирта может фактическизатормозить рост микроорганизмов и 45даже убить микроорганизм, поэтому еерегулируют так, чтобы спирт микроор-.ганизмы потребляли с той же скоростью,с какой спирт поступает в ферментер.Удовлетворительные условия достигают,если в выходящем потоке будет содержаться около 0,5 об. спирта, Для вы" сокой продъктйвности или скоростирост микроорганизмов концентрация.спирта, поступающего к ферментеру,будет составлять, примерно, от 7 до30 об,.Для периодического или непрерывно-го процесса концентрация вещества,идущего на переработку, например метанола, должна находиться между 60 0,001 и 5 об.% .и, предпочтительно, между 0,005 и 0,5 об.В другом случае при периодическом процессе ферментации питание можно добавлять порциями и постепенно.В процессе ферментации используют контрольно-измерительную аппаратуру для Рэмерения плотности микроорганизмов, рН, концентрации растворенного кислорода и спирта на входе и выходе из ферментера, обеспечивая тем самымполную систему управления процессом,Продукты, подаваемые в ферментер, обычно стерилизуют дйя предотвращения заражения смеси в ферментере нежелательными жизнеспособными микроорганизмами, Удаляемый из ферментера поток надлежащим образом обрабатывают для сепарации микроорганизмов, содержащих белок,. образующийся в одноклеточных организмах, например, с помощью тепла и/или химических реагентов, например кислоты для умерщвления микробиальных клеток и их отделения от водной, фазы посредством коагуляции или флоккуляции, После такой обработки смесь центрифугируют для удаления большей части жидкой фазы, и затем отделенные клетки сушат в барабанных или распылительных сушилках . Если в качестве культуры применяют дрожжи, вышеуказанные стадии обработкй могут быть йзменены". вначале про-, водят центрифугирование для сепарации клеток, которые. затем умерщвляют: под действием теплоты до или во вре-. мя последующей стадии сушки, После ,сепарации и сушки клетки, содержащие большое количество белка, готовы для использования в качестве источника питания для животных и/или людей . П р и м е р 1Проводят три опыта, в качестве источника углерода иэнергии используют метанол, которыйвводят в ферментер известного типа вусловиям пенообразования. Объем ферментера составляет, примерно, 1500 л.:В каждом опыте температуру поддержи,вают при 39 фС и рН - б,б. На выходеиз ферментера отсутствует метанол,концентрация которого составляет10 об., Питательной средой служитсреда, описанная выше, Используемыев каждом из этих опытов микроорганизмю пРедставляют собой виды бактерийРоецйошопао ве 1 Ьап 1 са под номеромЯВЯМ В 3449. Данные, представленные втабл. 1,получены после того, как каждый опыт достигает стадии готовности,примерно, через 12 час непрерывйой работы. Процесс идет при 3-х различныхдавленйях,706026 10 Таблица 1 Опыт 3 1,97810 2,6750 830 164 68,5 (при давлении на входе в 2,75 атм) 125 (при давлении на входе в 2 атм) 15 55 40 27022,7 (клетки, изолиров а нные фильтрацией пробы через фильтр Миллипор) 9 40 9 5 0 1 1 1 0 0,362,8 0,29 3,44 2,5 2,3 0,1755,73,3З,б 1,5 3,3 3,2175 2,5875 3,4875 8,8 8,9 Условия ферментации Давление, атмЗагрузка ферментера, кгПоток воздуха, м /час Растворенный 02 в ферментерев пересчете на содержание Обез присутствия клеток, ФУровень б в выходящем воздухе, в пересчете на нормальный О, содержащийся ввоздухе, %Скорость подачи среды 1/часСкорость подачи ИН 4 ОН,приблизительное значение Потребления ЮН,ОН (25 вес,Ъ ЮН), л/часВес сухих клеток, г/л Обороты мадалки, мин Расчетные величиныСкорость разведения, час Время пребывания, часНорма аэрации об/об, мин Т 1 отребляеьый О, кг/кг клеток Выход клеток, кгСНЗОН в пересчете на потребляемый метанол, кгНеочищенный белок (Ык 625),Ф Продуктивность г. клеток,л/час Результаты этих опытов показйвают повышенную продуктивность непрерывной ферментации при наполнении ферментера пеной и массопереносе кислорода около 1000 ммол О на л/час жидкой смеси. 2,3 430,6 24,6клетки, (клетки,изоизолиро- лированныеванные фильтрациейцентрифу-пробы черезгировани-фильтр Милем 10 м 3 липор)пробыпромывкаклеток,повторноецентрнфу-.гирование,сушка,взвещивание) Контрольный пример,Опыт, являющийся контрОльным по непрерывной ферментации,также выполняют с использованием той же бактериальной культуры, питательнсй среды и концентрации метанола, как в приме, При давлении на вхо.де в 2,75атм Уровень О в выходящем воздухе,при давлении на входе в 2,75 атмрН."" 35 4оты мешалки в минуту асчетные величины 014 124 Время пребывания, ча Норма аэрации, об/об мин клеток 28. Потребляемый О, кг/кг Вы 3 сод клеток, кг СКЛОН в пересчете на нормальный О, содержащийся в воздухе, клеток Неочищенный белок, приблизительное значение потребления НН,ОН(25 по весу ЯН),3,04 3, 29 5454 3,6 2,9 Продуктивность, г/л ре 1. Температуру поддерживают 404 Си рН - 6,3, близкие к величинам опытов примера 1. Этот опыт проводят вбольшей емкости обычного типа, снабженной лопастной мешалкой, так какемкость для ферментации работает при 5атмосферном давлении. Объем ферментйрующей смеси равен, примерно, 1125 л.В выходящем из ферментера потоке метанол не обнаруживают, Полученный вессухих клеток равен 19, 1 г/л. 10Результаты подсчета для этого опыта-следующие,Норма разведения, час 0,12Время пребывания, час 8,3Выход,кг СНОН/кг клеток . 4,0Неочищенный белок,75Продуктивность, г/л/час 2,3,Результаты этого опыта хуже резуль-,татов опыта 1 в примере 1, где исполь зчют ферментер с пеной. Загрузка ферментера, кгТемпература, СПоток воздуха, м 9/часРаствореннйй О в ферментерепри давлении на входе в 2 атм,Скорость загрузки среды, 1/ча Скорость подачи ЯН ОН в пересчете на содержание О без при сутствия клеток, л/час Вес сухих клеток, г/л Скорость разведения, ч П р и м е р 2. В опытах 4,5 (см, табл. 2) по непрерывной ферментации с метанолом используют ферментер, наполненный пеной, применявшийся в при мере 1, и ту же питательную средУ, но с культурой дрожжей.В этих опытах используют 10-ную концентрацию метанола, на выходе из ферментера в потоке метанол не обнаруживают. Каждый опыт проводят при атмосферном давлении.Во время .проведения опыта 4 устанавливают, что Ферментирующая смесь загрязнена филаментныйи грибками, по. этому перед проведением опыта 5 систему реактора стерилизуют. Данные опытов 4 и 5 представлены в табл . 2, которые рассматриваются как типичные "для процесса непрерйвной ферментации метанола при указанных условиях14 13 706026 Формула изобретения Составитель А. БражниковаРедактор Е, Гончар Техред Л,Алферова Корректор Е,Лукач Заказ 8075/66 Тираж 526 Подписное НИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб д; 4/5Филия П 81 ффПатентфф, г. Ужгород, ул. Проектная,Эти результаты демонстрируют ис=пользование дрожжей для непрерывнойферментации метанола в ферментере,заполненном пеной, для производствабелка одноклеточнйми организмами.Так как дрожжи обладают присущей 5им более низкой скоростью роста, чембактерии, производительность, показанная в табл. 2, ниже производительности, полученной при использованиибактерий. 10Белки одноклеточных организмов,полученные предлагаемым способом,приобретают особенно важное значение.В последние годы таких источниковбольшого количества недорогостоящихбелков, годных для употребления жи-вотными и людьми, как рыбная мука исоевые бобы, не хватает в связи с ростом народонаселения, Кроме того, происходит уменьшение производства рыбной муки, зависящего от улова анчоусов,Получение белков одноклеточныхорганизмов (ЗСР) может облегчить .проблему посредством обеспечения источника белка, который можно Ъключить в пищу домашней птицы, свинейи рогатого скота, что обеспечиваетбелками людей. Микробиальные клетки,полученные предлагаемым способом,являются подходящим источником белков и могут, таким образом, использоваться в качестве пищиа также,применены в других областях, например, для производства белковых клее, вых составов,Способ вЫращивания микроорганизмов, преимущественно бактерий и дрожжей, в условиях аэрации кислородсодержащим газом питательной среды, содержащей прямоцепочные алифатическиеспирты с 1-16 атомами углерода в молекуле в качестве источника углерода,источник.азота и необходимые минеральные соли, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью интенсификации процесса, аэрирование среды осуществляют так, что в процессе ферментации питательную среду с микроорганизмами поддерживают в виде пены сциркуляцией ее в процессе Ферментации.Источники информации,принятые во внимание при экспертизе1, Патент США Р 3,677895,кл. С 12 13 13/06, опублик, 1972.