Эталон для калибровки спектрофлуорометра

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИРЕСПУБЛИК 718058 А 19) 21/64 51) СУДАРСТВЕННЫИ КОМИТЕТО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ И ГКНТ СССР ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ итут им.(54) ЭТАЛОН ДЛЯ РОФЛУОРОМЕТР АЛИБРОВ ПЕКТТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВ(56) Авторское свидетельство СССРМ 1402865, кл. 6 01 1 21/64, 1986,О, Спеп В.Р. Н 1)огезсепсе Летаког йе гаи 9 е 0,1а. Воспеп 1. 19 Изобретение относится к технике оптических измерений, в частности к методамповерки и метрологической аттестации систем регистрации длительности оптическихимпульсов в наносекундном диапазоне длительностей и в видимой области спектраэлектромагнитного излучения.Известны кристаллические этанолы. уровня рассеянного света, величины коэффициента поглощения, длины волны испускания и возбуждения,Однако известные этанолы не позволяют проводить калибровку систем измерениядлительности импульсов флуоресценции,Между тем надежность и правильность флуорометрических измерений определяютсядвумя основными условиями: качествомконструкции прибора и качеством метрологического обслуживания при проведенииизмерений, Первое условие определяет ста(57) Изобретение относится к технике оптических измерений. Цель изобретения - повышение точности. Эталон представляет собой монокристаллический иттрий-алюминиевый гранат, активированный примесью церия, для которого характерны следующие особенности: строго одноэкспоненциал ьный закон затухания флуоресценции в диапазоне двух порядков; отсутствие перекрытия спектров поглощения и люминесценции; высокая термическая и фотохимическая стабильность; высокий квантовый выход люминесценции, не зависящий от длины волны возбуждения; высокая степень сохраняемости и удобство в эксплуатации, 3 ил. бильность работы самого прибора и зависит от его основных параметров. Второе условие включает в себя обеспечение сохранности показаний прибора, единства и - ф точности измерений, что составляет основную метрологическую задачу эксперимента, - а В связи с этим перед измерениями прибор 0 р необходимо стандартизировать, т.е. приводить к одной и той же чувствительности, Без проверки прибора незадолго до измерений и сразу после них трудно приписать определенный физический смысл параметрам наблюдаемого закона затухания. Это справедливо как для импульсных, так и для - а фазово-модуляционных измерений. Наиболее надежным методом, позволяющим судить о качестве аппаратуры, является исследование соединений с известным временем затухания, для которых закон затухания можно описать одной экспонентой. Длятаких соединений импульсная аппаратура должна дать только одно время затухания, для фазово-модуляционной аппаратуры должны получаться одни и те же значения фазовых и моделяционных времен затухания независимо от частоты модуляции, Если это не так, регулируют оптику и (или) электронные устройства, включая ФЭУ таким образом, чтобы результаты измерений удовлетворяли указанным требованиям.Кроме того, как для импульсных, так и для фазово-модуляционных измерений необходимо точно определять зависимость интенсивности возбуждающего света от времени с целью учета влияния аппаратной функции. Для импульсных измерений это временная зависимость интенсивности лампы, для фазово-модуляционного метода необходимо определять фазу возбуждающего света и степень его модуляции, Такие измерения для возбуждающего света обычно проводят, используя рассеянный свет (нулевое время затухания), а не отраженный, поскольку временные характеристики ФЭУ зависят от геометрии засветки фотокатода. Для этого на месте образца помещают рассеиватель и все измерения проводят в тех же условиях, что и для образца, однако регистрацию проводят не при длине волны испускания, а при длине волны возбуждения. Вследствие этого из-за зависимости временных характеристик ФЭУ от длины волны излучения могут возникнуть ошибки, связанные с различием длин волн при регистрации флуоресценции образца и лампы, Величина этих ошибок определяется как зависимостью временной характеристики фотокатода от длины волны света, так и оптическими факторами, связанными с тем, что рассеянный свет и излучение флуоресценции дают различные изображения на фотокатоде.В импульсных измерениях по измеренному с помощью данной аппаратуры времени жизни т эталона и известному его действительному значению проводят обратные расчеты по определению влияния аппаратной функции. В фазово-модуляционных измерениях эталоны позволяют получать сигналы, для которых известны соотношения между фазой и степенью модуляции возбуждающего пучка света, Флуоресценцию как стандарта, так и образца наблюдаютчерез интерференционный фильтр или через монохроматор, благодаря чему сравнение этих двух сигналов проводится при одинаковой геометрии, если оптические плотности 0 эталона и объекта примерно одинаковы (в этом случае изображения нафотокатоде в обоих случаях однотипны), ипри близких длинах волн, если свечение эталона расположено в той же или в близкой5 спектральной области, что и флуоресценцияэталона, При этом необходимо иметь ввидуследующее.При расчете действительной функциивысвечивания (исключение влияния аппа 10 ратной функции) в расчет закладывается одно- или многоэкспоненциальная модель ирассчитываются отклонения между этой моделью и полученной "чистой" функцией высвечивания, Вначале используется15 простейшая одноэкспоненциальная модельь, а затем двух- или и-экспонен циал ьная.Для более сложной модели расчетные отклонения всегда меньше, чем для более простой, однако если усложнение модели не20 дает заметных уменьшений систематических изменений и флуктуаций отклонений, считается, что действительный спадописывается более простой моделью. Следовательно, если эталон имеет одноэкспо 25 ненциальный спад известного значения, топри закладке в расчет модели с этим значением г должны быть получены минимальные значения отклонений рассчитанныхзначений от полученных в эксперименте.30 Иными словами, одноэкспоненциальныйспад, являясь наиболее жестко детерминированным во всем диапазоне спада, позволяет наиболее полно устранить влияниеаппаратной функции, поскольку он в наи 35 меньшей степени подвержен произволу привыборе модели,Таким образом, как для метрологического обслуживания флуорометрав, так идля учета влияния аппаратной функции не 40 обходимы эталоны моноэкспоненциальноговысвечивания флуоресценции,Известны растворы, которые могут бытьиспользованы в качестве эталонов квазиэкспоненциального высвечивания. Наблюдае 45 мая интенсивность, длительность испектральное распределение интенсивности флуоресценции могут зависеть от оптической плотности образца и условий егоосвещения. Оптимальным является наблю 50 дение флуоресценции под прямым углом ксередине центрально освещенной кюветы.Фронтальное освещение (флуоресценцияпоступает с той же поверхности, на которуюнаправляется излучение возбуждения), во 55 первых, увеличивает вероятность попадания на детектор флуоресценцииотраженных фотонов возбуждения, чтоуменьшает измеряемое значение т по сравнению с действительным. Во-вторых, уменьшается чувствительность вследствие того, что большая часть возбуждающего света отражается от поверхности образца, Однако при наблюдении флуоресценции ортогонально к направлению возбуждения за счет поглощения возбуждающего света при прохождении им образца его интенсивность уменьшается, а следовательно, уменьшается и интенсивность флуоресценции, В связи с этим фокусировку возбуждающего света необходимо проводить в центр кюветы, с тем, чтобы наиболее интенсивная флуоресценция наблюдалась в центре кюветы, т,е, из области, которая оптической системой отображается на катоде фотоприемника, а оптическую плотность О раствора выбирать не более 0,2 - 0,3,Кроме того, при перекрытии спектров поглощения и флуоресценции наблюдается вторичное поглощение (реабсорбция) света флуоресценции. В этом случае свечение коротковолновой части спектра, которое попадает в область перекрытия, выходит из толщи образца ослабленным по сравнению с длинноволновой частью, которая не меняется, В результате наблюдаемый спектр оказывается существенно искаженным за счет вторичного поглощения в его коротковолновой части, Вследствие зависимости постоянной времени ФЭУ от спектрального состава флуоресценции этот эффект может вносить погрешность в измерения т, поэтому для эталона должно иметь место минимальное перекрытие спектров поглощения и испускания.Поглощенный веществом свет флуоресценции может вновь возбуждать его молекулы, приводя к возникновению вторичной флуоресценции, Вторичное свечение также может быть поглощено веществом прежде, чем оно выйдет из исследуемого образца, что может вновь привести к возникновению флуоресценции, и т.д. Спектры флуоресценции вторичных и последующих свечений также могут быть искажены вторичным поглощением, На опыте наблюдается суммарный спектр флуоресценции всех возникших в растворе свечений, вследствие чего наблюдается и суммарное время высвечивания, которое, во-первых, больше действительного, и, во-вторых, может значительно отличаться от одноэкспоненциал ьного. Отсутствуют достаточно надежные методы учета указанных факторов, кроме выбора О раствора не более 0,1 - 0,5 и использования в качестве эталонов растворов с минимальным перекрытием спектров поглощения и испускания,Выбор размеров кюветы со стандартным раствором проводится следующим об 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 разом. С учетом абераций приемной оптической системы, которые для простых оптических систем в длинноволновом участке спектра достигают 1 мм, запаса на неточность наведения и угловую расходимость пучка флуоресценции, излучение флуоресценции редко собирается с площадки диаметром более 3 мм, а излучение лампы - в площадку диаметром менее 3 мм, С учетом удобства использования флуорометра необходим допуск на неточность наведения оптической системы на флуоресцирующий объем. Следовательно, для уменьшения вероятности сбора оптической системой возбуждающего излучения, рассеянного на входной и выходной гранях образца, при одновременном обеспечении возможности получения максимального сигнала диаметра флуоресцирующего объема должен быть не менее 5 мм, а диаметр граней, входных и выходных для возбуждающего излучения, не менее 5 мм, Общепринятым международным стандартом во флуоресцентной спектроскопии является применение кювет размером 10 х 10 мм. Держателями таких кювет снабжаются все приборы для измерений флуоресценции.При выборе длины волны возбуждения она должна быть наиболее близка к длине волны самой интенсивной линии источника возбуждения и одновременно быть близкой к длине волны максимума спектра поглощения, Длина волны возбуждающего света и область флуоресценции должны быть спектрально разделены 30 - 50 нм), Это связано с тем, что в приемник вместе с исследуемым излучением (флуоресцен цией) частично попадает и рассеянный свет (входная и выходная грани образца, рэлеевс кое и комбинационное рассеяние растворителя или матрицы). Рассеянный свет уменьшает измеряемое значение т по сравнению с действительным. Причем эти погрешности будут возрастать для веществ с малым квантовым выходом флуоресценции и для регистрирующих систем с высокой чувствительностью. Так, при возбуждении водных растворов сложных органических соединений светом длиной волны 365 нм (линия спектра ртутной лампы) пик рэлеевского рассеяния будет на длине волны 365 нм (первый порядок) и 730 нм (второй порядок решетки монохроматора), при этом будет одновременно наблюдаться пик комбинационного рассеяния на длине волны 416 нм, В том случае, когда длины волн возбуждения и люминисценции близки одна к другой, искажения из-за рассеяния не позволят точно измерить 7.Рассеянный свет можно отличить от флуоресценции по степени поляризации, т,е, его можно отсечь поляризационными фильтрациями, Однако такие фильтры, отличаясь сложностью, сильно снижают величину сигнала и тем самым понижают точность измерений. Для уменьшения влияния рассеянного света регистрируют интенсивность люминесценции через светофильтр, пропускающий длины волн, отличающиеся от длин волн возбуждения (метод скрещенных фильтров), Однако светофильтр может неравномерно поглощать излучение в зависимости от его спектрального пропускания, что будет вызывать искажение формы спектра флуоресценции и, как следствие, искажение измеряемой величин ы т вследствие зависимости постоянной времени ФЭУ от спектрального состава излучения. В связи с этим для эталона необходимо задавать спектральный диапазон возбуждения и регистрации. Третьим правилом при выборе длины волны возбуждения является использование длинно- волновой полосы поглощения, поскольку вероятность фотохимического разложения образца возрастает с уменьшением длины волны возбуждения,Таким образом, основными требованиями к эталону 7 являются следующие: возможность наблюдения флуоресценции ортогонально направлению возбуждения; размер входной и выходной граней для излучения возбуждения флуоресценции и грани, с которой производится наблюдение флуоресценции, 10 х 10 мм; в связи с воз 2,можной необходимостью ежедневного использования эталон должен быть механически и фотохимически стабилен; О должна находиться в диапазоне 0,1 - 0,5, слабое перекрытие спектров поглощения и флуоресценции; наличие интенсивной полосы поглощения в диапазоне Л 300 нм; высокий квантовый выход для получения уровня сигнала, достаточного для проведения точных измерений г в большом динамическом диапазоне спада интенсивности и значительно превышающего уровень рассеянного света.Однако применяемые в известном способе жидкие стандарты вследствие старения требуют периодического приготовления, отличающегося сложностью процедуры. Кроме того, предложенные стандарты имеют двухэкспоненциальное затухание, сильную зависимость времени жизни от температуры и длины волны регистрации, отсутствуют данные об их долго На фиг.1 приведена функция высвечива ния предлагаемого эталона при концентрации церия 0,1 и размерах кристалла 1 х 1 х 1 см, измеренная на приборе РВА (О = 0,2), Точность измерения времени жизни составляла 1 при значении 7= 59 нс, Длина вол ны возбуждения Л = 525 нм, длина волнырегистрации Л = 400 нм, Наблюдение флуоресценции ортогонально к направлению возбуждения; на фиг.2 и 3 - спектры погло щения и флуоресценции, измеренные на 50 приборе "Ярех". Точность измерений интенсивности в приведенных спектрах не хуже 1 , Длина волны возбуждения при измерении спектра флуоресценции Л, = 400 нм,Исследования зависимости формы им пульса флуоресценции от концентрации церия, оптической плотности, длины кристалла вдоль направления возбуждения, времени и температуры проводились в течение четырех лет. Рефлектор импульсной 5 10 15 20 25 30 35 временной стабильности (в течение года и более).Целью изобретения является повышение точности калибровки системы регистрации длительности световых импульсов при одновременном упрощении процедуры калибровки.Цель достигается тем, что в качестве эталона для калибровки системы регистрации по форме импульса флуоресценции используют монокристаллический иттрий-алюминиевый гранат, активированный примесью церия (УзАЪО 12:Се ) с концентрацией церия 0,05 - 0,3 весовых процента и оптической пл от н остью 0,1 - 0,3.Предлагаемый эталон отличается от известного тем, что в нем вместо раствора применен кубический кристалл иттрий-алюминиевого граната, активированный примесью церия с концентрацией (0,05 - 0,3)и О = Э,1 - 0,3. Поскольку использование монокристалла, в том числе кристалла иттрий-алюминиевого граната с примесью церия, в том числе с концентрацией церия (0,05 - 0,3)в качестве эталона времени высвечивания не обнаружено. Известно применение кристалла иттрий-алюминиевого граната с примесью церия в ядерной физике в качестве сцинцилляторов и сцинцилляционных экранов с максимально достижимой концентрацией церия, которая, как правило, составляет - 1 , Однако в этом случае указанный кристалл используется для визуализации излучения и изображений, а не в качестве эталона времени высвечивания, причем с концентрацией церия ф 1лампы фокусирует ее излучение в пятно с минимальным диаметром7 мм, в связи с чем размер граней эталона, входной и выходной для возбуждающего излучения, составлял 1 см. Этот размер соответствует стандартному держателю образцов, которыми снабжаются все флуорометры, и позволяет с учетом неточности наведения излучения лампы на объект надежно охватить весь поток возбуждающего флуоресценцию излучения. Длина эталона вдоль направления возбуждения 0,5 - 1 см выбиралась из условия, что с учетом аберраций оптической системы и неточности ее наведения на флуоресцирующий объем вся апертура сбора флуоресценции должна быть заполнена излучением флуоресценции. Это требование объясняется тем, что как эталон, так и исследуемый образец должны дать однотипные изображения на фотокатоде фотоприемника. Исходя из необходимости удовлетворения этому требованию выбирался и диапазон значений О эталона, который должен был соответствовать диапазону, наиболее часто используемому во флуорометрии и ограниченный значениями О = 0,1 - 0,5. Несмотря на то, что перекрытие спектров поглощения и флуоресценции (фиг.2 и 3) незначительно, однако при толщине кристалла 0,5 см и концентрации церия более 0,40(О = 0,4) наблюдалось многоэкспоненциальное затухание, В связи с этим диапазоне допустимых значений О эталона составляет 0,1 - 0,3, что при длине эталона 1 см соответствует диапазону значений концентрации церия 0,05 - 0,15 при длине 0,5 см - 0,1 - 0,3 ,В течение четырех лет в пределах погрешности измерений прибора РВА не было обнаружено зависимости тот длины волны возбуждения при изменении ее в диапазоне 350 - 540 нм, от длины волны регистрации при изменении ее в диапазоне 500 - 650 нм, от температуры в диапазоне ее изменений 10 - 50 С, О = 0,1 - 0,3, от толщины в диапазоне 0,5 - 1 см и концентрации в диапазонеП р и м е р 1. После проведения указаных исследований был изготовлен эталон с размером поверхности, на которую поступает излучение возбуждения флуоресценции, 10 х 10 мм при концентрации церия20,1 , Толщина эталона равна 10 мм и выбиралась из условия, чтобы О составляла (0,20 + 0,01) - наиболее часто используемое значение плотности, Поверхности, через которые проходит излучение возбуждения, полировались по 14 классу с целью сведения к минимуму уровня рассеяния возбуж 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 дающего излучения. Наблюдение флуоресценции проводится со стороны одной из боковых поверхностей перпендикулярно направлению возбуждения, Сами боковые поверхности могут быть неполированными, поскольку интенсивности флуоресценции вследствие высокого квантового выхода достаточно для надежных измерений. Поскольку кристалл кубический, нет зависимости коэффициента поглощения от состояния поляризации излучения, вследствие чего ориентация граней эталона относительно вектора поляризации излучения может быть любой. На фиг,1 в логарифмическом масштабе по шкале интенсивностей представлена функция высвечивания предлагаемого эталона.П р и м е р 2. Второй образец имел размер 10 х 10 х 10 мм, концентрация церия - 0,05 , О=0,1. Функция высвечивания для данного образца идентична представленной на фиг.1, условия наблюдения те же. П р и м е р 3, Третий образец имел размер 10 х 10 х 10 мм, концентрация церия - 0,15, О= 0,3. Функция высвечивания для данного образца идентична представленной на фиг,1, Условия наблюдения те же.Уменьшение О менее 0,1, во-первых, увеличивало время измерений более чем в 2 раза по сравнению с О = 0,2, во-вторых, не соответствовало диапазону значений О, наиболее часто исследуемых во флуорометрии (что может приводить к неидентичности геометрии засветки фотокатода фотоприемника при измерениях т эталона и объекта). Увеличение О более 0,3, во-первых, приводило к неодноэкспоненциальному затуханию, во-вторых, не соответствовало диапазону значений О, наиболее часто используемых во флуорометрии; в-третьих, приводило к неоправданному расходу церия; в-четвертых, увеличивало вероятность возникновения дефектов решетки,При калибровке системы регистрации на место исследуемого объекта квазиортогонально к направлению возбуждения полированными поверхностями устанавливается эталон, Через центр полированных граней пропускается излучение возбуждения с длиной волны 350 - 450 нм. Квазиортогонально направлению возбуждения, через центр одной из боковых граней проводится наблюдение излучения флуоресценции системой регистрации, позволяющей измерять форму импульса флуоресценции в спектральном диапазоне 500 - 650 нм. Отладка и настройка системы регистрации и (или) системы цифрового расчета1718058 чо31ф мц нсиг.1 импульса флуоресценции проводится до техпор, пока не будет получена одноэкспоненциальная форма среза импульса флуоресценции с величиной постоянной времениспада интенсивности флуоресценции в е 5раз = 59 нм,По сравнению с известным предлагаемый эталон обладает одноэкспоненциальным законом затухания флуоресценции;высокой термической и фотохимической 10стабильностью; высоким квантовым выходом люминесценции, не зависящей от длины волны возбуждающего света, Впредлагаемом эталоне отсутствует перекрывание спектров поглощения и люминесцен ции,Таким образом, предлагаемый эталон,который может быть изготовлен в виде твердого образца необходимого размера, средиизвестных эталонов обладает наиболее высокой степенью близости функции высвечивания к моноэкспоненциальной припостоянстве т и спектров поглощения и испускания в течение не менее четырех лет ив диапазоне температур 10 - 50 С при независимости 7 от длины волны возбуждения ирегистрации флуоресценции, Положениеполосы поглощения эталона совпадает с положением наиболее интенсивных линий вспектре излучения импульсных наносекундных ламп, работающих в воздухе или в азотеи являющихся основным источником возбуждения практически во всех спектрофлуорометрах, что позволяет проводить,эффективное возбуждение свечения эталона, Полосаизлучения эталона расположена вблизи максимума спектральной чувствительности подавляющего большинства фотоумножителей, вследствие чего имеет место высокий уровень сигнала, необходимый для измерений длительности светового импульса в широком диапазоне изменений интенсивности. Кроме того, высокая степень спектрального разделения спектра поглощения и флуоресценции обеспечивает возможность надежной спектральной фильтрации излучения флуоресценции от излучения лампы и тем самым повышение точности измерений (наличие в сигнале рассеянных фотонов импульса лампы уменьшает измеряемое г по сравнению с действительным), Эталон удобен в обращении и обладает большим сроком службы, поскольку является кристаллом. Формула изобретения Эталон для калибровки спектрофлуорометра по форме импульса флуоресценции, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения точности калибровки при одновременном упрощении процедуры калибровки, в качестве эталона используют монокристаллический иттрий-алюминиевый гранат активированный церием (У 2 АЪ 012:Се ) с концентрацией церия 0,05 - 0,3 весовых процента и оптической плотностью 0,1 - 0,3.,о 9 о а ь едактор О,Хрипта орректор О.Ципле Заказ 874 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раущская наб 4/5