Способ диагностики миастении

,ЯО 1 1)4 0 01 й 33/50 ф ю ,1 с 1 4 ПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕН Р 48рственный, меди. Гариши ачеиПо 1982,ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ(71) Пермский госудацинский институт(56) Руководство дляред. П.В.Мельничука,т.2, с.211-217,(54) СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ МИАСТЕНИИ(57) Изобретение предназначено дляневрологии. Цель изобретения - повышение точности диагностики. До и послевведения раствора проэерина берут пробькрови и добавляют суспензию эритроцитов барана, сенсибилизированныхацетилхолином. Смесь инкубируют.Затем определяют исходное содержаниерозеткообразующих лимфоцитов и сравнивают с изменением их уровня послевведения прозерина. Способ позволяетдиагностировать доклинические и субклинические формы нарушений нервно-мышечной передачи миастенического типа.3 табл.63074 2 1 13Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторной диагностике заболеваний, и может быть использовано для распознавания миастении,Целью изобретения является повышение точности диагностики за счет оценки состояния иммунной системы больного с измененным балансом ацетилхолина по реакции сенснбилизированных к нему лимфоцитов крови, усиленно взаимодействующих с эритроцитами барана, нагруженными ацетилхолином, что проявляется их повышенным содержанием (Ах-РОК) в крови (207 и более) и снижением их числа до нормальных цифр (10% и менее) через 30 мин после однократного подкожного введения больному 1 мл 0,05 -ного раствОра;прозерина (торможение Ах-РОК).Способ осуществляется следующим образом.Забирают одну-две капли крови (0,05-0,1 мл) из пальца больного в .центрифужную пробирку с 0,1-0,2 мл 57,-ного свежеприготовленного раствора цитрата для предупреждения свертывания крови. Вводят больному подкожно 1 мл 0,05%-ного раствора прозерина. Через 30 мин повторно забирают кровь из пальца, как описано ранее, После тщательного встряхивания пробирки в нее добавляют для лизирования эритроцитов 0,8-0,9 мл дистил,лированной воды. Суспензию клеток центрифугируют 5-6 мин при 1500 об/мин, после чего надосадочную жидкость отсасывают пипеткой, а осадок лимфоцитов ресуспендируют в 0,1-0,2 мл изотонического раствора хлорида натрия, К полученной взвеси лейкоцитов добавляют 0,1-0,2 мл 0,57.-ной взвеси эритроцитов, сенсибилизированных ацетилхолином и инкубируют смесь при 37 - 37,5 С в течение 5-6 мин, после чего центрифугируют при 1500 об/мин в течение 10-15 мин, Надосадочную жидкость удаляют с помощью пипетки, а осадок ресуспендируют в капле любой интактной сыворотки (бычьей, лошадиной, человеческой). Из полученной суспензии клеток делают мазок, который высушивают, фиксируют в метиловом (3-4 мин)или этиловом (20-25 мин) спирте и окрашивают по Романовскому-Гимза. Просматривают в мазке под микроскопом при 900-кратном увеличении 100 лимфоцитов, отмечая среди них число (7,) лимфоцитов, фиксировавших на себе три и более эритроцита. Зная содержание лимфоцитов (7)в крови больного и общий лейкоцитоз, высчитывают абсо лютное содержание лимфоцитов, фиксировавших на себе ацетилхолиновые эритроциты, в 1 мкл крови. Обработку эритроцитов барана глютаровым альдегидом производят, соединяя 0,5 мл 57-ной взвеси тщательно отмытых свежих эритроцитов с 0,257-ным свеже- приготовленным раствором глютарового альдегида в соотношении 1:1, Смесь выдерживают при 37 С в течение15 мин, после чего эритроциты тщательно отмывают от альдегида эабуференным изотоническим раствором хлорида натрия (рН 7,2) и доводят этим же раствором до первоначального объема (57-ная взвесь). Для сенсибилизации зритроцитов готовят раствор ацетилхолина с концентрацией 200 нг/мл на забуференном физиологическом растворе (рН 6,4). 1 мл 57.-ной взвеси глютаризированных эритроцитов центрифугируют, надосадочную жидкость удаляют, а к осадку эритроцитов приливают 1 мл раствора ацетилхолина. Смесь тщательйо встряхивают и выдерживают при 20-22 С 25-30 мин, после чего эритроциты дважды отмывают центрифугированием при 1500 об/мин в течение 5 мин изотоническим раствором хлорида натрия(рН 1,2) и им же доводят взвесь до первоначального объема (57.).П р и м е р 1, Больная И., 25 лет, поступила в клинику нервных болезней с жалобами на общую сла бость, быструю утомляемость рук и ног, затруднение при глотании, попадание пищи в нос, осиплость голоса при длительном разговоре. Из анамнеза известно, что заболела после физического переутомления, когда стала отмечать быструю, вначале непостояннув а потом все более длительную утомляемость в йогах, Через 2 мес, возник приступ слабости в руках, а спустя еще месяц появились затруднения при жевании, поперхивания при едеДиагностирована генерализованная Форма миастении средней тяжести, Проведено специфическое лечение (антихолинэстеразные препараты), и с улучшением больная выписана, Затем вновь поступила в клинику с ухудше 5 10 15 20 25 ЗО 35 40 45 50 5563074 40 45 50 55 3 3нием течения болезни, У больной отмечалось утомление при длительном жевании, слабость мьппц нижнемимической мускулатуры, осиплость голоса, дисфагия, слабость мышц рук и ног, Больная обследована. Анализ крови и мочи без патологии, На обзорной краниограмме патологии нет. Глазное дно не изменено. При исследовании электровозбудимости мышц обнаружено нарушение нервно-мьппечной передачи по миастеническому типу, Иммунологическим исследованием крови больной на содержание лимфоцитов, специфичных ацетилхолину, до и после введения прозерина установлено наличие характерного для миастении ответа, При проведении пробы с использование 0,05 мл крови, взятой из пальца больной до и через 30 мин после введения прозерина, добавления к ней 0,1 мл 57-ной суспензии эритроцитов барана, нагруженных ацетилхолином, и инкубации смеси при 37 С установлено исходное содержание розеткообразующих лимфоцитов, равное 437 (1138 в 1 мкл крови), и резкое падение их числа до 137 (165 в 1 мкл крови) после введения прозерина.П р и м е р 2, Больная С 24 лет, заболела после острого респираторного заболевания и эмоционального перенапряжения. Появилась диплопия в горизонтальной плоскости, однако она была непостоянной. После пребывания на юге двоение усилилось, опустилось левое векоДиагностирован базальный лептоменингит. Специфическое лечение эффекта не дало. Заподозрена опухоль мозга, по поводу чего произведена каротидная ангиография слева. Диагноз опухолевого процесса не подтвердился, Затем заподозрена миастения гравис, произведена прозериновая проба, которая дала отрицательный результат. В течение года диагноз поставлен не был. Состояние ухудшилось и больная поступила в клинику, Классическая прозериновая проба отрицательна. При лабораторных и параклинических методах обследования патологии не выявлено. При проведении иммунологической пробы 0,1 мл крови больной, взятой до и через 30 мин после введения прозерина, соединили с 0,2 мл 57-ной суспензии эритроцитов барана, нагруженных ацетилхолином, и инкубировали при 5 10 15 м20 25 30 35 37,5 С. Исходное содержание розеткообразующих лимфоцитов, специфичных ацетилхолину, в крови больной было повышенным и составляло 307. (504 в 1 мкл крови). После введения прозе- рина оно резко снизилось до 97 (143 в 1 мкл крови), что характеризует ответ, типичный для миастении. Осмотр больной установил наличие диплонии при взгляде вниз,экзофтальм, левосторонний птоэ, ограничение при движении глазных яблок кнаружи и кнутри, нарушение конвергенции. Поставлен диагноз: глазная форма миастенииПри дальнейшем наблюдении у больной появились слабость в руках и началась генерализация миастенического процесса.П р и м е р 3. Больной Г;, 33 лет, поступил в клинику нервных болезней с жалобами на постоянную резкую боль в поясничной области с иррадиацией в ногу по наружной поверхности бедер и голеней, онемение по наружному краю стоп, Боли усиливаются при движении, ходьбе, кашле, Болен в течение 5 лет, заболел после интенсивной физической нагрузки и переохлаждения. Последнее обострение возникло за 1,5 мес до поступления в клинику также после поднятия тяжести, Лечился амбулаторно, но улучшения не было.При обследовании отмечены резкая сглаженность поясничного лордоза, сколиоз с наклоном туловища влево, напряжение мьппц от поясничной области, больше слева, ограничение объема движений в поясничном отделе позвоночника, положительный симптом Ласега с двух сторон, больше слева, гиперстезия по наружной поверхности голеней. Коленные рефлексы живые, равные, пра-, вый ахиллов - снижен, левый - не вызывается.При рентгенографии позвоночнйка отмечено сужение межпозвонковой щели между 4-м и 5-м поясничными позвонка ми, выраженный поясничный сколиоз, аномалия первого крестцового позвонка.Диагноз: остеохондроз поясничнокрестцового отдела позвоночника, корешковый болевой синдром вследствие компрессии грыжей диска пятого поясничного корешка слева и частично справа. У больного имеются поражения периферической нервной системы. Ре5 13630зультаты иммунологической пробы: довведения прозерина 6%, после введения 317 Результаты пробы получены. при инкубации при й 37 С 0,05 млкрови, взятой иэ пальца больного дои через 30 мин после введения прозерина добавления к ней 0,1 мл 5%-нойсуспензии эритроцитов барана, нагруженных ацетилхолином. 10У больного тип иммунного ответана прозерин не:характерен для миастенического нарушения нервно-мьппеч ной передачи.П р и м е р 4. П-ва, 30 лет,практически здорова. Проба проведена с использованием 0,1 мл крови,взятой из пальца до и через, 30 минпосле введения прозерина, добавленияк ней 0,2 мл 5%-ной суспензии эри- ротроцитов барана, нагруженных ацетилхолином, и инкубации смеси при37,5 С. Число лимфоцитов, прореагировавших с ацетилхолиновыми эритроцитами до введения прозерина, 10%, 26через 30 мин после введения - 39%,т.е. наблюдался иммунный ответ, типичный для практически здоровых людей.Способ испытан на 20 больных сразличными формами миастении, из ниху 15 - генерализованная форма, у 5 -локальная (глазная). У всех обследуемых диагноз бып поставлен верно.Данные иммунологической пробы убольных миастенией приведены в табл.1.Данные иммунологической пробы убольных рассеянным склерозом и заболеванием периферической нервнойсистемы приведены в табл.3. 4 о 34 6Таким образом, результаты проведенных исследований показали, что иммунная картина крови до и после введения прозерина различна у больных миастенией, рассеянным склерозом, заболеваниями периферической нервной системы и у практически здоровых лиц. Таблица 1 Клиническийдиагноз Результатпробы после введенияпрозерина,до введенияпрозерина 10 Генерализованная форма миастении 41 То же 30 32 Глазная форма миастении 24 Число лимфоцитов, взаимодействующих с ацетилхолиновыми эритроцитами, % Ввиду высокой чувствительности предлагаемый способ дает возможность диагностировать доклинические и субклинические формы нарушений нервно- мышечной передачи миастенического типа, ранней и объективной иммуно"д диагностики миастении, так как он основан на регистрации ранних минимальных нарушений регуляции иммунной. системой баланса ацетилхолина, изменений его минимальных концен 1 траций. Формула изобретения Способ диагностики миастении путем введения больному раствора проэернна с последующим исследованием эффекта его воздействия, о т л ич а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения точности способа, пробу крови исследуют до и спустя полчаса после введения раствора прозерина, затем добавляют в пробу 0,1-0,2 мл 57-ной суспензии эритроцитов барана, нагруженных ацетилхолином, инкубируют смесь при 37-37,5 С с последующим подсчетом в мазке розеткообразующих лимфоцитов и при снижении их исходного числа с 247 и выше до 137. и ниже диагностируют миастению.1363074 Продолжение табл,1 11 до введения после введения прозерина прозерина 40 24 То же 13 43 30 33 То же 28 35 32 Глазная форма миастении 28 То же 29 31 Глазная форма миастении 26 33 То же 30 38 8+0,47 32,1 й 1,13 П р и м е ч а н и е: + положительная проба;и и+ - достоверность отличия с фоном Р ( 0,001. Число лимфоцитов, взаимодействующих с ацетилхолиновыми эритроцитами, 7. Результатпробы Клиническийдиагноз Генерализованнаяформа миастении Глазная формамиастении Генерализованная формамиастении Генерализованная формамиастении Генерализованная формамиастении(фон)10 27 30 7 28 4 35 15 3930,0+1,54" 107,2 + 0,51 29 20 Достоверность отличия с фоном Р 0,001. 32 Таблица 3 Результатпробы Число сенсибилизированных к ацетилхолину лимФоцитов, Е до введения про- через 30 минзерина после введения прозеринаРассеянный склероз 31 21 23 32 20 31 21 39 27 22,4+1,34 33,6+1,53" Заболевания периферической нервной системы39 10. 30 24 31 Число сенсибилизированныхкацетилхолину лимфоцитов 7. до введения через 30 минпрозерина после введения(фон)прозерина Резуль.тат:1пробы через 30 минпосле введенияпрозерина Ре зультатыпробы12 1363074 Продолжение табл.3 Число сенсибилизированных к ацетилхолину лимфоцитов, 7 Результатпробы до введения про- через 30 минзерина после введенияпрозерина 31 21 25 26 10 32 30 29, О+1, 84+ 7,4+0,51 П р и м е ч а н и е: "Ф "- проба положительная, т.к.свидетельствует об изменении баланса ацетилхолина,но не характерна для миастенического типа нарушений в нервно-мьппечном аппарате; проба отрицательнаяъРедактор И,Рыбченко Корректор В.Гирняк Подписное Заказ 6398/34 Тираж 776 ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д, 4/5