Способ исследования биологических объектов

, С 01 В 21 ПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ(71) Ереванский. ордена ТрудовогоКрасного Знамени государственныйуниверситет(54) СПОСОБ ИССЛЕДОВАНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТОВ(57) Изобретение относится к способам исследования биологических объектов и может быть использовано длякомплексного анализа фотосинтеэирующих объектов. Целью изобретения является повыщение точности и информативности анализа. Цель достигаетсяза счет построения термограмм флуоресценции. Для выявления преобладания в объекте фотосистемы 1 или фотосистемы 11 объект возбуждают в диапазоне длин волн 400-550 нм. Затемрегистрируют зависимость интенсивности флуоресценции образца от температуры в диапазоне длин волн 650 -770 нм. На термограммах получаютпики, соответствующие фотосистеме 1и фотосистеме 11. Расчитаны относительные содержания фотосистем. 6 ил.2 табл.12543Изобретение относится к способам для проведецегл оптического анализа фотосцстем (ФС) фотосинтезирующих Объектов и может быть использовано в области биологических научных исследований, а также в области сельского хозяйства,Цель изобретения - сокращениетрудоемкости, поньппение точности иинфорггативцостц,Известно, что в Фотосинтеэирующихрастительных клетках в красной области спектра ответственным за флуоресценцлпо является молекула хлорофилаа Фотосистемы 11. При этом квантовыйвыход Флуоресцеццееи коррелирует сфункциоцальной активностью Фотасинтетического аппарата, Однако в цоргеаггьцых условиях хлорофил ФС Флуоресцирует незначительно, и использование Флуоресцецции в аналити-ческих целях почти невозможно. При,ицактивации последнего квацтовый вы.ход флуоресцецциц хлорофила увеличи-" 25вается. ЭТО Объясняется тем что, вклетке возбужденная молекула хлороФилл эффектцвгго использует энергиюна Фотосинтез, а при инактивации - нафлуоресцеццию. При этом квантовый вы- ЗОход Флуоресценции хлорофилл а увеличивается це только у фотосистемы11, цо и у фотосистемы 1,1 азработагг способ для получениядискретной информации от ФСи .ФС.Благодаря селективной ицактивацииФСи ФСвысокой культурой и однонремецггому возбуждению и регистрациииэ Флуоресцецции, получены термограммьг Флуоресценции. Расшифроваегы ники,.соответствующие ФСи ФС, Найдены способы проведения анализа с помопгью этегх пиковв частности дл 51определения относительного содержания фотосистем, Фуцкциоцальной активности хлоропластов и определениягенетической устойчивости растений кэкстремлльным воздействиям,На фиг, 1 и 2 показано устройстводдя реализации способа; ца фцг. 3терлгогралема флуоресцецции листа А 1 с 111 аь 11 а 8 гозз 1 геппг 1 интенсивности све,чения; ца Фиг. 4 - кинетика затуханияпослесвсчения листьев А 1 с 11(ш 111 а РгоззЬепп 11 нл Фиг. 5 и 6 - термограммыС55Флуоресггецггегп рлзлегчнггх биологическихОбъектов,Способ реализуется устройством(Фцг. 1), содержащим по ходу луча 60 2источцик света, линзы, светофильтры,гпторки Фотоприемцик и регистриру 10 щее устройство, отличающееся тем,чтов него введены термоячейкл с датчикомтемпературы, скрещивающие светофильтры с возможностью возбуждать и выделять Флуоресценцию обоих Фотосистем,а также быстродействующий затвор стрехщелевой шторкой с возможностью ихпоочередного открывания и закрывания.Устройство (фиг. 1) содержит триотсека (Л, Б, В) в светонепроницаемуюкамер 5 1, на основании которой собрана оптико-механическая часть устройства, К отсеку В снаружи вмонтированосветитель 2 с лаггпой накаливания 3коцдецсатором 4, жидкостным (СцС 1 )5.1 и стеклянным 5,2 светофильтрами,а внутри этого отсека прикрепленылинза б и призма 7, которые .совместнос призмами 8 и 9 (отсек Б) формируетпучок возбуждающего света, затвор10, датчик температурьг 11, Фотоумножитель 12, светофильтр 13,В отсеке Б смонтирован также затвор 10 со щелевой шторкой 11 (фиг.1и 2), состоящей из кожуха шторки 14 сдвумя окошками для возбуждающего света 15 и регистрации люминесценции 16,Шторка 11 выполнена в виде пластинкис тремя щелями: одна общая 17 для регистрации послесвечения и флуоресценции, а две другие - для возбужденияфлуоресценции 18 и послесвечегпгя 19,Затвор снабжен также двумя пружинами20 и 21, заводно-пусковыле рычагом22, приводящим затвор в действие,двумя защелками 23,1, 23.2 с пружинами 24,1, 24,2, Фиксирующими положение шторки и двумя пусковыми шнурами 25,1, 252,В отсеке Б прикрепляется такжесъемегая массивная термоячейка 26,выполненная из латуни с внутреннимэлектрическим нагревателем обеспечиавающим равномерный нагрев (3 С в.минуту), снабженная объектодержателемс датчиком температуры 11. В отсеке А вмонтированы Фотоумножитель (ФЭУ) 12 и светофильтр 13 для регистрации люминесценции. Питание ФЭУ осуществляется высоковольтным выпрямителем 27, для усиления сигнала ФЭУ использован усилитель постоянного.тока 28, а регистрация проводится на самописце 29 или на Осциллографе 30. Для питания осветителя и термоячейки использован Фер1254360 4с- руют ицтецсиьцость стационарной флуоресцецции в зависимости от температуры в интервале 25 - 27 С, При этомобразец нагревают с постоянной скоростью (примерно 3 град/мин), Флуоа ресценц 1 по объекта возбуждают таким - образом, чтоГ. ФСи ФСвозбужда-.лись одновременно, что осуществляется с помощью светофильтра в диапазоО це 400-550 нм, а интенсивность Флуоресцецции ФСи ФСрегистрируютна 650-770 нм через красный свето, Фильтр Нами исследована зависимостьфлуоресценции от температуры около т 15 100 листьев растений рЬазо 1 цз чи 1 даг 1 з и Л 1 с 11.пп 11 а дгозз 1 е 1 дп 1., т В табл. 1 представлены данные измерений по одному типичному листу. ОСФ =1 о45 рорезоцансный стабилизатор и трапформатор 31, 32, 33,Устройство работает следующим образом.Для регистрации послесвечениявключается электропитание устройствфиг. 1), затем ицтактзцый фотосинтезирующий объект с держателем помещается в термояцейку 26, и щелеваяшторка 10 приводится в рабочее положение. Для этого заводно-пусковымрьгчагом 22 шторка вытягивается,приэтом натягиваются пружины 21,1, 22,и заведенная шторка удерживается защелкой 23. При этом шторка закрываеокно 6 фотоумножителя и открываетокно возбуждающего света 15, Свет озаранее включенного источника с помощью оптических систем - линзы 4,светофильтра 5.1, 5.2, линзы б,призм 207, 8,9, Фокусируется на образец.После 10-20 с освещепия образца нажимом ца рычаг 22 освобождается шторка10 от защелки 23 и под действиемпружины 20, 21 шторка мгновенно 25(0,005 с) закрывает окошко возбуждающего света 15 и одновременно открывает окопного фотоумножителя 16.Приэтом свет послесвечения фотосинтезирующего образца (точнее от Фотосисте-З 0мы 11) переходит через светофильтри попадает на фотоумножитель. Возникающий фототок усиливается с помощьюусилителя постоянного тока, и на осциллографе или ца самописце реГистрируется кицетика затухания интенсивности свечения от времени,Как видно из табл, 1, в области температуры 45-70 С интенсивностьоФлуоресцецциц резко возрастает и пио ки обнаруживаются при Т = 55 и Т = 65 С.На фиг. 3 кривой 34 представлена термограмма флуоресценции листа Л 1 с 11 пп 11 а гозвЬе 1.пппб, произрастающего в вь 1 сокогорцых условиях (3200 м от уровня моря), а кривой 35 - термограмма растения, произросшего В долицньи условиях (1100 м от уровня моря).Относительное содержание фотосистем (ОСФ) определяется по отношеншоДля изучения зависимости послесвечения от температуры вкл 1 очением тер 40 моячейки 26 образец нагревается до желаемой температуры, и затем регистрируется кинетика послесвечения,Для регистрации флуоресценции и термоицдуцированного изменения флуоресценции образца достаточно во вто ь рой раз нажать на рычаг 22. При этом отодвигается защелка 23 и шторка 10 окончательно продвигается внутрь кожуха, свет источника 3 проходит от щели шторки 19 на образец для возбуждения Флуоресценции, Одновременно включается самописец 29, термоячейка 26 с датчиком температуры 1, и запи сывается интенсивность флуоресценции в зависимости от температуры.П р и м е р 1, Для определения относительного содержания Фотосистем фотосинтезирующего объекта регистриДля высокогорных растений отношение ФСи ФСсоставляет 1,04 1, а для растений долины - 0,947, Из приведенных соотношений видно, что у образца, произраставшего в условиях высокогорья, ФСменьше, чем ФС.1Относительная Функциональная активность хлоропластов (Л) определяется по отношецшоЛ =55;65С падением величины отношения, начи.ная с единицы, Функциональная актив- НОС 1 Ь ПОНЬШ 1 аЕТСяе ДЛЯ ВЫСОКОГОРНЫХ образцов оцо составляет 0,888, а для растении, произраста 1 ощнх в услогиях долины, составляет 0,842. Таким образом, относительная Функциональная активность хлоропластов в высокогорных условиях гораздо ниже.5 12543П р и м е р 2, Для определенияотносительной Функциональной активности ЭТЦ между Фотосистемами регистрируют послесвечекие листьев н зависимости от температуры и по отношению5А.,= 1 о/1 .максимумов судят об" ц (активности,На Фпг, 4 представлена кинетиказатухания послесвечения листьевЛ 1 сЬпп 11 а цгоззЬе 1 ю 11, произраставших в условиях высокогорья при комнатной температуре - кривая ЗЬ, при40 оС - кривая 37. К 1,ивой 38 и 39соответственно представлены послесвечения у растений, произраставших вусловиях долины, Односцтельная функциональнал активность ЭТЦ между ФС уобразцов высокогорных условий составляет 0,500, а н условиях долины0,442, т,е. у растений, произраставших н условиях, активность значительно ниже.П р ц и е р 3. С целью иллюстрации преимущества предлагаемого способа приведены результаты исследования по пзучешпо термоицдуцпронанногоизменсния выхода стационарной Флуоресцснции при разных этапах Формирования илц при селекгивном разрушении Фотосистем.30На Фцг. 5 представлены термограммы Флуоресценции цормальньгх (кривая40) и этиолированных листьев ячменя(кривая 41), Как видно, на первомэтапе Формирования мембран преобладает ФС. 11 ри Формировании Фотосин 35тетического аппарата сначала Формируется ФС, а затем ФС, а у нормального листа ФСпреобладае надФС.40На Фиг, б представлены термограммы флуоресцецции нормального листаФасоли до (кривая 42) и после облучения (кривая 43) рубиновым лазером(1 = 6943 Л, 4 10 Вт,/м), Под действием излучения рубинового лазерапроисходит в основном селективнаядеструкция ФС, о чем свидетельствует исчезновение пика в области65 С,50П р и м е р 4. Разработанньгйспособ исследования Фотосицтезирующих обьектов можно успешно применятьдля определения генетической устойчивости растений к экстремальным воз 55действиям окружающей среды. Цчя определения устойчивости растений к действиям орицательцой температуры опытный вариант растения подвергают дей 60 6стнию отрицательной температуры (3 мин - 5 С) в холодильную камеру.оРегистрируют зависимость интенсивности Флуоресценции от температуры опытных и контрольных листьев, а генетическую устойчивость (ГУ) определякт по соотношениюс 7 1 агде 1 и 1 , - интенсивность Флуоресо Оценции опытного образцапри 55 С и 25 С соответственно;11 и 1 - интенсивность Флуорес 66ценции контрольного образца при 55 С и 25 С.В табл, 2 сопоставлени данные флуоресцентных показателей генетической устойчивости растений с известной устойчивостью к отрицательным температурам,Как видно из приведенных данных,высокогорные растения по сравнению срастениями, произрастающими н условиях долины, обладают более высокойустойчивостью к низким температурам,т.е. высокогорние растения более морозоустойчивы,Таким образом, изобретение позволяет провести точный анализ фотосистем и их функционирования, значительно уменьшить трудоемкость работы иповысить информативность за счет проведения анализа на живых фотосицтезирующих объектах.Формула изобретенияСпособ исследования биологических объектов путем облучения объекта и измерения вторичного излучения, о тл и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения точности и информативности за счет выявления преобладания в объекте фотосистемы 1 или фотосистемы 11 и для определения Функциональной активности хлоропластов и генетической устойчивости растений, объект возбуждают излучением в диапазоне длин волн 400-500 нм и регистрируют зависимость интенсивности флуоресценчии образца от температуры в диапазоне длин волн 650-770 нм, и селектцруют Фотосистемы по пикам при этом первый пик нри температуре 50 -о60 С соответствует Фотосистеме 11, а второй пик при температуре 60-70 СФотосистеме 1, и определяют по Фор1 12543 ЬОмулам относительное содержание фотосистем (ОСФ): 8ГУ =- 1 - 10 ОЖ ОСФ= ,16 еф Таблица 165 70 0 35 40 45 .5 емпература, С 5 60. 2 флутенсивнос есценции,отН,Е 99 85 77 112 128 1 РЬазо 1 цз чц 18 аг А 1 сМв 111 аП 1 гоззЬе.6 117 1 13 1 14 1 1 5 1 16 1 20 130 лиц растений Генетическая моро"зоустойчиность (ГУ),7 Бодяк (произраставщий на высоте.3500 м) Бодяк (произраставщий на высоте 1000 м) 95 Одуванчик высокгорный Вероника высогорная 5 солькуруза 5 функциональную активность (А) хлоропластов:А = Лл%5 в 65генетическую устойсивость (ГУ) расте ний где 1., 1 . - интенсивность флуорсценции исследуемогообъекта при 55 С и25"С соответственно;1 , 1 , - интенсивность флуоресценции колтрольногообъекта при 55 С ио25 С соответственно.-, Корректор Реда овту ерик одписное 4/5 венно-полиграфическое предприятие, г; Ужгород, ул ктная,роиз тоа И 80 гп О ЮО гд О Заказ 4713/47ВНИИПИ Госудпо делам и113035, Иосква 30 О О