Способ получения комплекса ферментов

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСНРЕСПУБЛИК А НИЯ ОБРЕТ ЛЬСТ Во во ОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР ДЕЛАМ ИЭОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТ ОПИСАНИЕ АВТОРСКОМУ СВИД 1(211 3422521/28-131(221. 17. 02. 82(711 Институт ботаникиим Н.Г.Холодного АН Украинской ССР .. ФЕРМЕНТОВ путем культивирования. высших базидиальных грибов на питательной среде, содержащей источник. углерода, минералЬные соли: однозамещенный фосфат аммония, однозамещенный фосфат калия, двузамещенныйФосфат калия, сульват магния, и водус последующим отделением. Фильтратакультуральной жидкости от мицелияи остатков твердого субстрата,о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, сцелью расширения ассортимента ферментрв в комплексе, повышения выхода целлюлоз, пектиназ, пероксидазы,монофенолмонооксигеназы и снижения ЗСЮ С 12 Б 9/00; С 12 д 1/20 себестоимости получаемого продукта, применяют комплексную среду, в которой используют в качестве источников углерода целлюлозу в виде отходов фильтровальной бумаги или солоьы, экстракт из свекловичного жома и гидрол, а также дополнительно вносят тиамин при следующем соотношении компонентов, мас.В: Целлюлоза 1,30-1,50 Экстракт.из свекловичного жома 8,80-9,00 Гидрол0,40-0,50Тиамин 0,00015-0,00020 Одноэамещенный фосфат аммония 0,17-0 у 20 Одноэамещенный Фосфат калия 0,05-0 у 06 Двуэамещенный фосфат калия 0,03-0,04 Магний сернокислый 0,04-0,05 да водопродная До 100,0 2. Способ по п. 1, о т л и ч а ющ и й с я, тем, что после отделения культуральной жидкости от твердой Фазы проводят дополнительную экстракцию ферментов, иммобилизованных на твердых компонентах питательной (ф среды 0,5 н. ацетатным буфером при р рН 4,0 в течение часа при 10 С.310 20 Изобретение относится к ферментной отраоли микробиологической про ьааленности, а именно к способамполучения ферментов, и может быть,использовано в производстве фермен"тов, и может быть использовано впроизводстве ферментов и других биологически активных веществ, .применяемых в винодельческой, кон- сервной, фармацевтической, химической промышленности, а также в сель ском хозяйстве,Известны способы получения ферментов, в частности целлюлоз, пектиназ,монофенолмонооксигеназ и пероксидаэы, которые предусматривают. культивирование их продуцентов, напримерплесневых грибов, дрожжей, высшихбаэидиальных грибов и др.на питательной среде, содержащей воду,минеральные соли и органическиедобавки с,последующим отделениемкультуральной жидкости от мицелияи остатков твердого субстрата.Органические добавки, могут включатьисточники углерода, источники азота, 25соединения, стимулирующие, биосинтезотдельных Ферментов, например солому, опилки, хлопок, фильтровальнуюбумагу, мякоть свеклы, свекловичныйжом, экстракты из .свекловичного 30жома, виноградных выжимок, солодо-.вых ростков, н др. 1 3НЕдостатком известных способовявляется то, что они позволяктинтенсифицировать биосинтез отдельных .35ферментов, однако для эфФективногогидролиза сложных субстратов, например, в пищевой промышленности, припереработке отходов лесной, деревообрабатывакщей промышленности, 40сельского хозяйства и. др. требуется .применение ферментных комплексов,включающих одновременно высокоактивные целлюлозы, пектинаэы, монофенолмонооксигеназы и пероксидазу. 45Наиболее близким по техническойсущности и достигаемому положительному эффекту к предлагаемому является, способ получения комплексаферментов путем культивированиявысших баэидиальных грибов на питательной среде, содержащей источникуглерода, минеральные соли: одноэамещенный фосфат калия, двузамещенный Фосфат калия, однозамещенный,фосфат аммония, сульфат магния, и воду, 55с последующИм отделением Филь тратакультуральной жидкости от мицелия иостатков твердого субстрата, согласнокоторому, наряду с высшим базидиальным грибом, культивирует низший 60гриб, например Р 1 ецго 1 ца ав 1 гаа 1 цви .Рцааг 3 цп йц 1 щогшп 2 3Недостатками известного способаявляются высокая стоимость и технологическая сложность выращивания 65 одновременно двух культур, отсюда - большой расход посевного материала, а также недостаточно широкий ассор-. тимент ферментов.Целью изобретения является расширение. ассортимента ферментов в комплексе, повышение выхода целлюлоз, пек 1 инаэ, пероксидазы, монофенолмюнооксигеназы и снижения себестоимости получаемого продукта.Поставленная цель достигается тем, что согласно .способу получения комплекса Ферментов путем культивирования высших базидиальных грибов на питательной, среде, содержащей .источник углерода, минеральные соли: одназамещенный фосфат аммония, однозамещенный фосфат калия, двузамещенный фосфат калия, сульфат магния, и воду с последующим отделением 1 фильтрата культуральной жидкостиот мицелия и остатков твердого субстрата, применяют кбмплексную среду, в которой используют в качестве источников углерода целлюлозу в виде отходов фильтровальной бумаги или соломы, экстракт свекличного жома и гидрол, а также дополнительно вносят тиамин приследующем соотношении компонентов, мас.Ъ:Целлюлоза . 1,3-1,5Экстракт из свекловичного жома 8,8-9,0Гидрол0,4-0,5фТиамин 0,00015-0,00020Однозамещенныйфосфат аммония . 0,17-0,20ОднозамещенныйФосфат калия 0,05-0,06Двузамещенныйфосфат калия 0,03-0,04Магний сернокислый 0,04-0,05Вода водопроводная До 100После отделения культуральной жидкости от твердой фазы проводят дополнительную экстракцию ферментов, иммобилиэованных на твердых компонентах питательной среди 0,5 н.ацетатным буфером при рН 4,0 в течение часа при 10 С.П р и м е р 1. Использовали Сог 1 о 1 ца п 1 гацца 069, который выращивали при 26-28 С методом поверхностной пленки на комплексной питательной среде следующего состава, мас,Ъ:Среда 1Фильтровальная бумага 1,31Экстракт иэ свекловичного жома 8,80Гидрол . 0,43Тиамин 0,00015БН 4.Н РО+ 0,170,0520,035М 8 О 4 0,043Вода водопроводная . До 1001068477 10 40 культура,56,7 56,7 25,2 83,га, озы изу ц я бу Ъ гл идр юло 133,5 Экзокана за Карбокситилцеллюлоза, мгглюкозы 4,5 0 В качестве контроля использовалитакже питательные среды, которыевключают компоненты, стимулирующиебиосинтез отдельных ферментов -целлюлоза (среда 2 1, пектиназ (среда 3), монофенолмоноокситеназ5(среда 4) мас.Ъ:Среда 2Фнльтровальная бумага 1,47Тиамин 0,00015Я Н 4 НРО 4 0,19КНРР 04, . 0,059КЯНР 04 0,039Исаа 0,049Вода водопроводная До 100Среда 3 15Экстракт иэ свекловичного жома9,0Тиамин 0,00015ННН РО+ 0,18КН 2 Р 04 О, 054 20К 2 4 0,036М 88 О 4 0,045Вода водопроводная До 100Среда 4Гидрол 0,49 25Тиамин . . 0,00015БННРО 0,20КН РО+ 0,059К 2 НРО 4 .0,039И 88 О 0049 ЗОВода водопроводная До 100, В процессе культивирования Сог 1 о 1 цз ЬхгзцСцв на третьи, шестые идесятые сутки определяли способностьк гидролизу нерастворимой целлюлозы,а также активности эндо,4-,-глюканаэы, экэо,4-ф-глюканазн, полйгалактуроназы экэополигалактуроиазы,пектинэкстеразы, монофенолмонооксигенаэы (полифенолоксидаза, лаккаэа)и пероксмдаэы в фильтратах культу- .ральной жидкости, получаемых путемотделения мицелия и остатков твердого субстрата. Результаты измерений представлены в табл. 1, изкоторой следует, что использование 45комплексной среды, содержащейодновременно соединения, стимулирующие биосинтез указанных ферментов,позволяет с 1,5 г 4,0 Раза интенсифицировать процесс и расширить ассортимент Ферментов комплекса,Экстрагирование 0,5 н.ацетатнымбуфером рН 4,0 иэ остатков твердого субстрата в течение 1 ч при 110 вС позволило дополнительно увеличить выход эндо,4-,Ь-глюканаэы, экэо,4глюканаэы, полигалактуроназы,. экзополигалактуроназы и пектинэсктеразы .(табл, 2)П р им е р 2. В качестве продуцента использовали Сог 1 о 1 цв чегв 1 со 1 ог (Рг). Вце 1, пе 1 087., Состав среды 1, мас.%Филътровальная бумага 1,40Экстракт иэ свекловичного жома 9,00Ридрол 0,50Тиамин 0,00015ВННРО 4 0,20КН 2 РО 4 0,06КНР 9, 0,.045Вода До 100Полученные результаты представлены в табл, 3(уровни активностей внеклеточных ферментов при выращивании на комплексных средах с целлюлозой в виде отходов фильтровальной бумаги (1) нли соломы (2), В контроле - среды, где в качестве единственного источника углерода испольэовали отходы фильтровальной бумаги (3), солому (4), экстракт из свекловичного жома (5) илн гидрол (6), .(5-суточная культура).. П р и м е р 3. Состав сред и условия культивированияаналогичны примеру 1. Продуцент Р 1 ецго 1 цв авгеаСцз (Рг) Кцшв шт. К, Время культивирования 10 сут.В табл. 4 представлена активность Р 1 ецгоСцв азСгеаФцз Кна различных средах.П р и м е р 4. Состав сред аналогично примеру 1. Продуцент 1 грех 1 ас 1 ецз Рг. 0187.Полученные результаты представлены в табл. 5. Изобретение позволяет снизить себестоимость готового продукта примерно на 30.Таким образом, реализация изобретения обеспечивает расширение ассортимента ферментов в комплексе, повышение выхода целлюзол, пектиназ, пероксидаэы, монофенолмонооксигенаэы, и снизить себестоимость получаемого, продукта. Т а блица 11068477 Продолжение табл.1 3-суточная культура 6-суточная культура Фермент Субстрат 1 3 4фтшещ авашв Мвмеаеевеюювюю е 10,6 4,6 6,8 2,6 13,4 7,7 6,8 4,9 Полигалактуронаэа 31,2 21,137,0 33,3 250,0 100,0 142,8 111,1 Экэополигалак"туроназа 5,6 1,7 3,7 3,0 1,5 1,0 1,5 2,6 0,1 0,20,1 0,3 0,10,2 0,1 0 Монофенолмонооксигенаэа Еензидин,ед/мл КоноФенол- монооксигеназа Пирокатехин,ед/мл Пероксидаза Бензидин,ед/мл 1,4 О .ф 0 0 5,4 0,6 0,9 5,6 Продолжение табл. 1 10-суточная культура фермент Варианты йитательной среды1 Способность кгидролизу целлюлозы 50,7 0 Экэо,4-фглюканаза 59,0 102,0 0 Эндо, 4-3 глюканаэа 37,0 2,7 5,7 4,0 Полигалактуроназа1068477 10-суточная культура фермен Варианты питательной с 23 Пектинэкстераза 0,1 Монофенолмонооксигеназ 2 О Монофенолмонооксигеназа 0,6 О,Пероксидаэа 0 10,8 П р и м.,и е. аблица 10 суточнаякультура 6-суточнакультура-суточнаультура бстра ермен арианты питательной сред1 й1 к 0 0 6 0 ЭкзОу 4-фглюканаза,5 0 0,9 0,9 ктинэкераза 0 0 а н и е. 1 - комплексная питательная среда согласно изобретению;" среда с фильтровальной бумагой. рим собность идролизу ллюлозы ильтровальнаяумага, мг.Влюкозы Карбоксиметилцеллюлоза,мг.В глюкозы Карбоксиметилцеллюлоза,Ф деполимери- зации Пекти вичны ед/мл Высокометоксилированный пектин, ед/мл 1 - комплексная пита но изобретениювальной бумагой; том из стекловичн с гидролом. 8Продолжение табл.1 ельная среда соглас - среда с фильтроф - среда с экстракого жома Й - среда. 5,8 13,Ь Бензидин,ед/мл бф 45 юЗ 12,0 7 ф 8 5,6 Т а б л и ц а 4 Комплекснаясреда Среда сгидролом Субстрат Фермент Экзо, 4-рглюканаза0 280 юЗОю 4 0 Эндо,4-Дглюканаза 18 ф 5 4,9 27,0 Полигалактуроназа 5 О, 3 6 25, О Эк зополи- галактуро- наэа Пектоваякислота,ед/мл 0,10 0,34 Монофенол- монооксиге- наза Карбоксиметилцеллюлоза, мг В Карбоксиметилцеллюлоза, усп. Ъ Фильтровальная бумага, мг В. Пектинсвекловичный, ед/мл Пектоваякислота,ед/мл Высокометоксилированный пектин, ед/мл Карбоксиметилцеллюлоэа,мгЪ Карбоксиметилцеллюлоэа, % деполиме- ризации Пектин свекловичный,ед/мл Комплексные среды3 Среда сцеллюлозой Контрольные среды 1 1 Среда сэкстрактом изжома1068477 Продолжение табл.4 Пектинэксстераза 0 Следы Бензидин,ед/мл Пероксидаза 0,27 0 Бензидин,ед/мл 18,0 0,9 25,4 Следы Таблица 5 Комплекснаясреда Среда сгидролом Среда с. Составитель Е. ВоробьеваРедактор Г. Волкова ТехрЕд .С,Мигунова Корректор А, Тяско Заказ 11805 Тираж 525 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5Филиал ППП "Патентф, г. ужгород, ул. Проектная, 4 Монофенолмонооксигеназа Эндополигалактуроназа. Экзополи- галактуро- наза Монофенол.монооксиганаза Высокометоксилированныйпектин, ед/мл 0,27 Карбоксиметилцеллюлоэа,мг В Карбоксиметилцеллюло Уа,Ъ деполимериэации Пектин свекловичный,ед/мл Пектоваякислота,ед/мл Среда сцеллюлозой экстрактом из.жома