Способ изготовления камеры длякультивирования клеток

ОПИСАНИЕИЗОБРЕТЕНИЯК АВТОРСКОМУ СВИ ЕТЕЛЬСТВУ(22) Заявлено 0404,78 (21) 2599541/28-13 Р 1) М Кл Союз Советских Социалистичесних Ресиубликс присоединением заявки йо С 12 К 1/00(23) Приоритет Государственный комитет СССР ио делам изобретений и открытийДата опубликования описания 1504 В 1 72) Авторы изобретения И.П. Билько, В.Г. Войцеховский, В,В. Гашинский и Н.М. Клишина Киевский ордена Трудового Красного Знамени медицинскийинститут им. акад. А.А. Богомольца и Киейгкийнаучно-исследовательский институт гема(54) СПОСОБ ИЗГОТОВЛЕНИЯ КАМЕРЦ ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КЛЕТОК Изобретение относится к микробиологическим и гематологическим видам исследований, связанных с выращиванием клеток 1 п ч 1 хо и 1 п.ч 1 чо, и может быть исследовано в микробиологических, гематологических, иммунологических и других исследованиях при создании камер для закономерностей роста и развития клеток (микро,организмов, тканевых клеток) и определения влияния на них различных факторов.Наиболее близким к изобретению по технической сущности является способ изготовления камеры для культивиро вания клеток, заключающийся в том, что формируют стенки и днище с образованием полости для взвеси клеток, закрывают крышкой и герметизируют.Стенки камеры по известному спо собу изготавливают иэ пластмассовых колец, а крышку изготавливают из миллипоровых фильтров путем нанесения на фильтр насечек, стерилизации и вырезания затем кружков. Полученные кружки тщательно приклеивают к кольцам клеем, полученным путем раст" ворения Фильтров в ацетоне так, чтобы матовая сторона их была обращена к клеткам (она считается менее ток 30 сичной). Затем камеры в разобранном виде помещают в чашки Петри и стерилиэуют под лучами бактерицидной лампы. В последующем кольца с фильтрамн помещают на увлажненные средой 199 стерильные марлевые салфетки. В кольца вносят среду 199 для проверки качества Фильтра и. герметичности камеры. В стерильных условиях на фильтры в кольца помещают исследуемую суспензию клеток.,Ожидают, пока культуральная среда просочится через Фильтры и на них останутся только клетки. Потом накладывают кольца друг на друга (меньшее в большее), придавливают сверху лопаткой для сопоставления и герметиэируют, проклеивая щель между ними клеем. Полученные таким образом камеры имплантируют в организм животного (1).К недостаткам известного способа относятся сложность и трудоемкость изготовления большого количества камер, а также то, что полученные камеры, хотя и позволяют выращивать клетки Ы чиччо и 1 п .ч 1"гоф однако они выполнены из оптически непрозрачных материалов, что не позволяет осуществлять наблюдение эа одними и теми же отдельными клетками вдинамике их роста и развития непос- редственнО в камере; для изучения исследуемых клеток камера, в которой они выращивались, должна быть демонтирована, клетки извлечены и перенесены на предметное стекло, что нарушает первоначальное взаимораспо)ложение клеток, их Форму и размеры. Часть клеток может разрушаться, Камера .не позволяет осуществлять непосредственное наблюдение эа ростом, размножением и дифференцировкой исследуемых клеток под контролем микроскопа в состоянии их развития. Камера имеет жесткую структуру, что отрицательно влияет на организм животного при имплантации. Методика не позволяет получать одновременно необходимое количество камер, так как каждая из них готовится, отдельно.Цель изобретения - упрощение, удешевление способа и возможность иссле дования клеток в камере на разных этапах их развития.Для достижения этой цели стенки днища и крышку выполняют иэ полиакриламидного геля, при этом стенки и 25 днище формируют, заливая рабочий раствор в пространство между двумя параллельными пластинами, верхняя из которых имеет выступы для образования полостей в нижней пластине,. полимеризуют смесь до образования геля и снимают верхнюю пластину, а герметизацию камеры проводят путем наложения сверху листового материала с образованием зазора между ним и крыш кой, заливают рабочий раствор и полимеризуют до образования геля, снимают листовой материал и выштамповывают камеру.На фиг.1 изображена камера для культивирования клеток, общий вид; 40 на Фиг.2 - формирование полосы для размещен.я клеток; на фиг.З - приготовление плоской гелевой пластины; на фиг.4 - введение в полости суспенэии клеток и накладывание крышек; на 45 Фиг.5 - герметизация камер путем закрепления крышек в гелевой массе; на фиг.б - вырезание камер.Камера готовится следующим образом. 50Берут четыре плексигласовые пластины 1 - 4. На поверхность пластины 1 в шахматном порядке на расстоянии примерно 15-20 мм приклеивают водо- стойким клеем предварительно выре" эанные из пластика или медицинской резины плоские кружки 5 диаметром б мм и толщиной 1-2 мм (фиг.2 а). Пластины стерилизуют кипячением.Пластину 1 накладывают на прямоугольные плексигласовые подставки б 40 толщиной 2-3 мм, расположенные по бокам пластины 2 таким образом, что- бы плоскость с приклеенными кружками 5 пластины 1 была обращена к пластине 2 (фиг.2 а,б) . Пластину 3 65 накладывают на прямоугольные плексигласовые подставки 7 толщиной 1-2 мм,расположенные по бокам пластины 4(фиг.За,б) . Профильтрованные черезбактериальные фильтры рабочие раст" .воры для получения полиакриламидногогеля смешивают (стерильно) и заливают в пространство между пластинами 1 и 2 (фиг.26) и 3 и 4 (фиг,Зб). При этом капиллярные силы удерживают жидкость между пластинами, смесь растворов полимеризуют через 15- 20 мин (в зависимости от режима полимеризаций) . После этого пластйны1 и 2 снимают с подставок. На пластине 2 остается гелевая пластина с полостями 8 (фиг,2 в), а на пластине 4плоская гелевая пластина (фиг,Зв).Из плоской гелевой пластины сверлами для пробок вырезают кружки, выполняющие функцию крышек 9 диаметр которых на 2-3 мм больше диаметра полостей 8. В полости 8 вносят исследуемые клетки (фиг.4 а). Сверху полости 8 покрывают крышками 9.При исследовании в камере неприкрепляющих клеток (например, подвижных микроорганизмов) последние прижимают ко дну луночки гелевым кружком, диаметр которого соответствует диаметру луночки. При этом камера будет без внутренней полости.Герметизацию камеры осуществляют следующим образом.По бокам плексигласовой пластины 2 устанавливают подставки 10 таких размеров, что после положения на них листового материала или пластины 3 образуется зазор в 1-2 ю между этим материалом (пластиной) и крышкой 9, В образовавшееся пространство заливают смесь рабочих растворов, которая, полимеризуясь, соединяет пластины между собой (фиг.5 б) . Листовой материал (плексйгласовую пластину 3) снимают с подставок 10, Сверлами для пробок диаметром 12- 15 мм вырезают камеры.Изготовленные камеры отмывают в Физиологическом растворе МаС 1 растворе Хенкса, среде 199 в зависимости от того, какие клетки подлежат исследованию. В дальнейшем камеры имплантируют в организмживотного или помещают в питательную среду при культивировании 1 п уЫго.Методика предусматривает изготовление одновременно камеры различных размеров и в необходимом количестве в зависимости от целей исследования,Камеры,изготовленные по предлагаемому способу иэ полиакриламидного геля, обеспечивают возможность изучения одних и тех же отдельных кле" ток в динамике их роста и развития. Для этого. клетки подвергают микроско пированию непосредственно в камере. Для облегчения нахождения клеток в камеру совместно с клетками при их821484 Формула изобретения иФ посеве можно вводить специальные маркеры (частицы активированного угля, убитые дрожжевые клетки и др.) . Через необходимое время камеры извлекают из организма или питательной среды, Под микроскопом находят ту же группу клеток и подвергают исследованию. При необходимости пастеров- ской пипеткой клетки могут быть извлечены иэ камеры. Камеру можно.повоторно имплантировать в организм или помещать в питательную среду.Изготовление камер из полиакриламидного геля обеспечивает оптическую прозрачность, которая позволяет проводить наблюдения исследуеьих клеток световой микроскопией в динами ке их роста и размножения. Камеры эластичны, хорошо переносятся животными и обладают способностью конфигурировать в полостях при имплантации в организм даже при одновремен) ной имплантации одному животному 2-3 камер.Основными преимуществами иэготов" ленных камер данным способом являются оптическая прозрачность, эластичность, биологическая инертность используемого для изготовления камер материала. Способ их изготовления более прост, доступен и позволяет од" новременно получать необходимое количество камер.ЗО Способ изготовления камеры для культивирования клеток, заключающийся в том, что формируют стенки и днище с образованием полости, закрывают крышкой и :герметизируют, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с це.лью упрощения, удешевления способа и возможности исследования клеток в камеру на разных этапах их развития, стенки, днище и крышку выполняют из полиакриламидйого геля, при этом стенки и днище формируют, заливают рабочий раствор в пространство между двумя параллельными пластинами, верхняя иэ которых имеет выступы для образования полостей в нижней пластине, полимеризуют смесь до образования геля и снимают верхнюю пластину, а герметизацию камеры проводят путем наложения, сверху листово. го материала с образованием зазора между ним и крышкой, заливают рабочий раствор и полимериэуют до образования геля, снимают листовой материал и выштамповывают камеру. Источники информации, принятые во внимание при экспертизе1. Евгеньева Г.П. Иежклеточные взаимодействия и их роль в эволюции. М.,Наука, 1976, с.31-37.821484 Составитель И Техред А.Баби ин а 18/40 аказ П фПатентф 1, г. Ужгород, ул ктная,лиал Редактор Т, ПарФЕ ВНИИПИ Госудапо делам3035, Москва, Жтираж 528ственного комитета СССэобретений и открытий Раушская наб д. 4/5 Корректор С. ШекмарПодписное