Способ индукции партеногенеза у растений

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК ПИСА Е ИЗОБ ТЕНИ К АВТОРСкО СВИДЕТЕЛЬСТВУ ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОВЕДОМСТВО СССР(56) Бритиков Е.А. Биологическая роль пролина. М.: "Наука", 1975, с. 66-73,Авторское свидетельство СССР1 Ф 520957, кл, А 01 Н 1/02, 1975.Авторское свидетельство СССРМ 1323048, кл, А 01 Н 1/04, 1985,2 Ьао 2 цоуц, бц Мпб-ццап 9, Ргобцс 11 опо Оро 1 б Рцге .1 пез о 1 Маге ВгоцдЬРаг 1 Ьеподепез 1 з 1 пбцсео Ьу СЬегп 1 са 1 з,-Ассадепе 11 са з 1 п 1 са, 1984, ч 11, п.1, р. 39 - 46. Изобретение относится к растениеводству и селекции сельскохозяйственных культур, в частности, к применению химических веществ для экспериментального индуцирования апомиктичного (партеногенетического) развития женских генеративных элементов 1 п ч 1 чо, и может быть использовано в гетерозисной селекции растений как этап для разработки методов ускоренного получения гомоэиготных линиЯ и апомиктичных диплоидных форм растений, закрепляющих эффект гетероэиса в первом гибридном поколении, а также в физиологии и генетике растений для изучения путей индукции и развития экспериментального апомиксиса, явлений оплодотворения и эмбриогенеза, механизма активации мегагамет.(54) СПОСОБ ИНДУКЦИИ ПАРТЕНОГЕНЕЗА У РАСТЕНИЙ(57) Использование: биотехнология. цитогенетические исследования, сельское хозяйство, физиология растений, Сущность изобретения; партеногенез у растений индуцируют в результате обработки женских генеративных органов с мегагаметами витальными дозами индуцирующего вещества, изменяющего кальциевый гомеостаэ в сторону увеличения содержания свободных ионов кальция в мегагаметах при сохранении их витальности и функционирования. 14 з.п, ф-лы, 2 табл., 1 ил. Цель изобретения - расширение спект- ара (набора) универсально партеногенез-ин- рр дуцирующих веществ при увеличении выхода партеногенетических форм,Поставленная цель достигается тем. что в способе индукции партеногенеэа у растений, включающем кастрацию и изолирова- Оф ние соцветий или цветков до цветения,обработку в них, после начала цветения, женских генеративных органов с мегагаметами биологически активными веществами индуцирующими партеногенеэ, морфобиологический контроль индукции, обработку осуществляют витальными дозами индуцирующего вещества, изменяющего кальциевый гомеостаз в. сторону увеличения содержания свободных ионов кальция в мегагаметах при сохранении их витальности иФункционирования, например, поверхностчо активного вещества типа детергента - этанола. а контроль осуществляют цитоэмбриологически по сохранению витальности мегагамет и их активации к партеногенетическому развитию, В качестве индуцирующих веществ кроме поверхностно-активных веществ типа этанола, используют также вещества антиауксинового действия, например, рутин, кумарин, другие флавоноиды из монофенолов и М-дифенолов; вещества из переносчиков и каналоформеров, повышающие проницаемость мембран для ионов кальция, например, грамицидины, карбоксильные полиэфирные антибиотики типа А 23187. лазолоцида А, цитокинины типа 6- бенэиламинопурина, 6-фураноаминопурина, эеатина; переносчики химической энергии типа аденозинтрифосфорной кислоты; вещества, повышающие проницаемость мембран растительной клетки, деполяриэующие их и понижающие мембранный потенциал, например, натриевая соль никотинамидадениндинуклеотида, глутатион, рибофлавин, холекальциферол; вещества, в растворе диссоциирующие на свободные ионы кальция и любые анионы, например, хлорид кальция, нитрат кальция,Используемую в заявленном способе группу индуцирующих веществ органической или неорганической природы, необладающих токсическим действием на растение, ненарушающих жизнеспособности и функционирования мегагамет и обьединенных физиологическим действием на кальциевый гомеостаэ, приводящим к увеличению содержания свободных ионов кальция в цитозоле мегагамет, никогда не использовали в качестве действующих веществ в способах индукции партеногенеза у -растений; партеногенез индуцирующий эффект этих веществ не был известен, не был очевиден и не мог быть логическим путем выведен, исходя иэ структурных формул их молекул или известного физиологического действия их как веществ, действующих на кальциевый гомеостаэ растительной клетки.Изменение кальциевого гомеостаза под действием этих веществ (но нв влияние на партеногенеэ) было известно, Причем, известно, что в любой клетке, включая растительную, находящуюся в состоянии динамического равновесия с окружающей средой, концентрация свободных ионов кальция равна 10 Моль/л, а вне клетки - 10 Моль/л. В связи с этим введение кальция в клетку или высвобождение его из компартментов, т.е. повышение эидогенного содержания свободных ионов кальция, инициирует ряд биологических процессов. При этом связь между повышением эндогенногосодержания ионов кальция в цитозоле мега. гамет и индукцией партеногенеэа у растений оставалась до настоящего времени5 неизвестной и неочевидной, хотя укаэанный в заявленном способе набор веществфункционально обьединяется именно такимдействием на кальциевый гомеостаз клетки.В силу всего вышеизложенного, предлагае 10 мое техническое решение неочевидно, обладает новизной и существеннымиотличиями.Использование вышеупомянутых веществ в качестве универсально партеноге 15 неэ-индуцирующих в составе смеси,воздействие которой по указанному способу приводит к активации мегагамет и индукции партеногенеэа у растений присохранении их витальности, расширяет20 спектр (набор) веществ, использовавшихсядо настоящего времени для индукции партеногенеза, увеличивает выход партеногенетических форм. Ранее известноиспользование вышеупомянутых веществ25 только в качестве активаторов или ингибиторов роста растений, антибиотиков, фиксаторов, стерилизаторов, макросолей приминеральной подкормке вегетирующих растений. поверхностно-активных веществ и30 т,пно не в качестве универсально партеногенеэ-индуцирующих веществ.На чертеже дана зависимость выходапартеногенетических форм в процентномвыражении (на оси У) от концентрации эта 35 мола, используемого в заявленном способев качестве индуцирующего вещества, в процентном выражении (на оси Х),Способ осуществляется следующим образом. До начала цветения на стадии еще40 незрелых зародышевых мешков кастрируютсоцветия или цветки, удаляя пыльники до ихрастрескивания и высыпания из них пыльцы; изолируют кастрированные соцветияили цветки, например, пергаментными изо 4 б ляторами для предотвращения случайногопопадания любой пыльцы на их женскиегенеративные органы; после начала цветения их обрабатывают индуцирующим веществом, например, вводят раствор одного из50 вышеуказанного набора индуцирующих веществ (например, этанола). Наиболее оптимальным является способ введения, прикотором индуцирующее веществО вводитсяв центральную ось соцветия или цветка, чем55 достигается эффект снижения расхода вещества и оптимальной доставки его к местунепосредственного действия, т.е, к мегагаметам. В качестве растворителя используютлюбое вещество, не обладающее токсическим действием на растение, например, во 18226815 1 О 15 20 25 30 35 ду, Концентрацию индуцирующего вещества берут витальную, причем его витальность и индуцирующий эффект контролируют цитоэмбриологически по сохранению жизнеспособности мега гамет и эффекту активации их к партеногенетическому развитию (нвпример, к пролиферации и т,п,).П р и м е р 1. Экспериментальное доказательство осуществимости способа проводили на материале кукурузы сложного гибрида КоллективныйТВ. Женские соцветия (початки) кукурузы с однополыми женскими цветками изолировали зв 3.5 дней до начала цветения (до выметывания первых нитей рылец) на стадии незрелого зародышевого мешка пергаментными изоляторами, чтобы предотвратить последующее случайное опыление завязей.На 27 сутки после начала цветения проводили иньекцию партеногенеэ-индуцирующего вещества - этанола как одного из наиболев доступных веществ, изменяющих кальциевый гомеостаз клетки, в виде водного раствора в концентрации 150 в обьеме 2 мл на одно соцветие с помощью шприца-доэатора комбинированного ШДК в центральную ось початка,Верхний предел концентраций 50 брали, исходя иэ того, что зганол в этой концентрации используют в цитологии как фиксирующее вещество, т.е. воздействие этанолом данной концентрации приводит к летальному исходу для растения (Паушева З.П. Практикум по цитологии растений. - М,: Колос, 1980. - С. 70-76),Идентификацию витальности мегагамет и индукции партеногенеза у них на ранних стадиях развития производили по цитоэмбриологическим маркерным признакам индуцированного партеногенетического развития яйцеклеток и вторичных ядер центральных клеток зародышевых мешков, Для этого на 310 сутки после иньекции раствора этилового спирта фиксировали в фиксаторе Чемберлена часть завязей с обработанных початков. Состав фиксатора Чемберлена: 90 частей этанола 70-ного; 5 частей ледяной уксусной кислоты: 5 частей 40-ного формальдегида. Препараты зародышевых мешков готовили по ускоренной методике, включающей окраску 2-ным ацетокармином, вычленение семяпочек макроиглами, мвцерацию их комплексом ферментов из зобной железы виноградной улитки (цитазой). вычленение зародышевых мешков микропрепаровальными иглами и приготовление глицерин-желатиновых препаратов. Из каждого соцветия початка 40 45 50 55 цитоэмбриологически изучено в среднем по 30 семяпочек.Выход партеногенетических форм кукурузы, индуцированных к развитию действием водного раствора этилового спирта в сравнении с прототипом, приведен в табл.1. Выход партеногенетических форм выражали отношением числа индуцированных к партеногенетическому (апомиктичному) развитию завязей к числу проаналиэированных завязей початка.Из данных табл. 1 следует, что выход партеногенетических форм в заявленном способе превышает таковой в прототипе по совокупности вариантов обработки в 13 раэ (2,48 6/0,19 ), а по вариантам с максимальным выходом апомиктичных форм - в 35 раз (10.52/0,30 6).Интервал оптимальных концентраций индуцирующего вещества этанола в заявленном способе определяли по результатам графического анализа (фиг.). Причем, оптимальными концентрациями этанола считали те, которые давали выход партеногенетических форм выше максимального показателя такового по прототипу, т.е. выше 0,46 по сорту Зюцоапц(указано на фиг, горизонтальной прерывистой линией), Это интервал оптимальных концентраций этанола - 1,10- 47.ОО УТаким образом, использование заявленного способа в случае, когда в качестве индуцирующего вещества берут этанол, как одно из веществ, изменяющих кальциевый гомеостаз мегагамет, эффективно для кукурузы гибрида КоллективныйТВ.П р и м е р 2. Экспериментальное доказательство осуществимости способа проводили на материале кукурузы сложных гибридов КоллективныйТВ, ВИРи гомозиготной мужскостерильной линии ЮВТС в соответствии с описанием способа, данным в примере 1.В качестве индуцирующих использовали ряд биологически активных веществ, изменяющих кальциевый гомеостаэ, указанных в пунктах 27 формулы изобретения.Результаты испытания приведены в табл. 2,Таким образом, использованный в примере специфический набор биологически активных веществ расширяет спектр универсально партеногенез-индуцирующих веществ у растений. Причем в табл, 2 приведены только те концентрации веществ, при воздействии которыми наблюдали максимальный эффект индукции партеногснеза, Проблему наиболее экономичного выхода на оптимальные параметрыконцентраций решали следующим образом: брали максимальную из витальных для растения доз и расширяли интервал концентраций индуцирующего вещества в сторону уменьшения на 34 порядка, испытывая при этом внутри интервала 57 уровней концентрации, Контроль витальности и индукции партеногенеза вели по цитоэмбриологическим признакам.Результаты испытания свидетельствуют о том, что все из апробированных веществ превосходят прототип по выходу партеногенетических форм в 9120 раэ (4.1755,17 против 0,46 по прототипу).Таким образом, осуществление заявленного способа в случае использования ряда веществ, указанных в п,п, 1,7 формулы изобретения, в отношении индукции и выхода партеногенеза эффективно для трех селекционных форм кукурузы,Аналогичные результаты, подтверждающие расширение спектра и универсальность таким образом специфически подобран;ых индуцирующих веществ, получены для просе посевного и томата. Ф о р мул а изобретения 1. Способ индукции партеногенеза у растений, включающий кастрацию. изолирование соцветий или цветков до начала цвете, ия, обработку г, них после начала цвегения женских генеративных органов с мегагаметами биологически активными веществами, индуцирующими партеногенез, и последующий морфобиологический контроль индукции, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью увеличения выхода партеногенетических форм и расширения спектра универсально партеногенез-индуцирующих веществ, обработку осуществляют витальными дозами индуцирующего вещества, изменяющего кальциевый гомеостаз в стооону увеличения содержания свободных ионов кальция в мегагаметах при сохранении их витальности и функционирования, а контроль осуществляют цитоэмбриологически по сохранению витальности мегагамет и их активации к партеногенетическому развитию,2. Способ поп. 1, от лича ю щийс ятем, что в качестве индуцирующего вещест, ва используют иоверхностно-активные вещества типа детергента.5 3, Способпоп.2, отличающийсятем, что используют этанол.4. Способ по п. 1, о т л и ч а ю щ и й с ятем, что в качестве индуцирующего вещества используют вещества антиауксиноеого10 действия.5, Способ по п. 4, о т л и ч а ю щ и й с ятем, что используют рутин, кумарин.6. Способ по п. 1, о т л и ч а ю щ и й с ятем,.что в качестве индуцирующего вещест 15 ев используют вещества из переносчиков иканалоформеров, повышающие проницаемость мембран для ионов кальция.7. Способ поп,6, отличающийсятем, что используют грамицидины С и Д.20 8,Способпоп.1, отличающийсятем, что в качестве индуцирующего вещества используют цитокинины,9, Способпоп.8, отл ича ющийсятем, что используют 6-бенэиламинопурин.25 10. Способпоп.1, отличающийсятем, что е качестве индуцирующего вещества используют переносчики химическойэнергии,11, Способпоп.10, отличающийся30 тем, что используют аденозинтрифосфорную кислоту.12. Способпоп.1, отличающийсятем, что в качестве индуцирующего вещества используют вещества, повышающие про 35 ницаемость мембран и приводящие кдеполяризации и понижению мембранногопотенциала.13, Способ поп,12, отличающийсятем, что используют натриевую соль никоти 40 намидадениндинуклеотида, глутатион, рибофлавин, холекальциферол.14. Способ по п. 1, о т л и ч а ю щ и й с ятем, что в качестве индуцирующего вещества используют вещества, в растворе диссо 45 циирующие на свободные ионы кальция илюбые анионы.15. Способ по п. 14, о т л и ч а ю щ и й с ятем, что используют хлорид кальция, нитраткальция."Бензиламинопури 40 мг/л 172 ,54 1 О мг сАнтиау ксийЬ . Кумари н 1 О О О мг12Продолжение табл,2 1822681 Переносчики химической энергии ВИР240 10,13 Колл. 147 ТВ 6,67 Никотинамидаденинди"нуклеотид-Иа 100 мг/л Рибофлавин 20 мг/л Холекальциферол 0,125 Колл. 147 ТОСоли кальция 0 СоставительТехред М.Моргентал орректор О. Кравцова Редактор Заказ 2164 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СС 113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5