Способ получения декстраназы

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК 2 М 9/46 12 й 9/46, 1/112 й 1/66) ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТВЕДОМСТВО СССР(5 ТНОЕ ЕТЕ ИСАН ЕЛЬСТВУ АВТОРСКОМ няться в пищевой промышленности и ине. С целью упрощения способа и ения процесса эа счет сокращения в культивирования продуцента в питаую среду, на которой выращивают мицет Азрегдоз пзцешз ВКПМ Р- носят в качестве индуктора синтеза раназы и источника углерода культуую жидкость .еосопоз 1 оз гпезепте- ВКПМ Вс содержанием декстра мг/мл и редуцирующих веществ мг/мл. Преимущество предлагаемого ба заключается в доступности и легкоиготовления индуктора, снижении его нтрации в питательной среде в 1,5-2 сокращении сроков культивирования цента в ферментере на 18 ч при сохравысокого уровня декстраназной ак- (/) сти до 80 ед./мл, 6 табл. приме медиц ускор сроко тельн микро 342 в 54) СПОС 57) Изоб ии, а име назы и СО 8-581 10-12; МаКОз - 0,3; КС - 0,05; Мд 304 7 Н 20 - 0,05; КН 2 Р 04 - 0,1; автолизат дрож- О жевой или ферментолизат биомассы микро- р организмов - 0,2-0,5; рН 5,0-5,2 (вода - остальное), Культивирование ведут в течение 84 часов в колбах на качалке (180 об/мин) или 42-48 часов в ферментере при поотоянном перемешивании (200 об/мин), ); аэрации - 1 объем воздуха/1 обьем сре- а ды/мин и температуре от 29 до 31 С, В качестве посевного материала используют 48- часовой инокулюм, полученный в колбах на питательной среде вышеприведенного состава,Таким образом, декстран вводится в питательную среду непосредственно в составе культуральной жидкостиецсопоз 1 ос(71) Институт микробиологии АН БССР и Научно-производственное объединение "Биотехнология"(72) А.Г.Лобанок, О.Н,Зинченко, Г,А.Молодова, Т.И.Данилова, А.К.Хасирджева, В.И.Шило, З,А.Рожкова, Е.И.Беленькая, И.И,Кюдулас, О,Е,Анченко и В.И,Лауцюс (56) Авторское свидетельство СССР М 896069, кл. С 12 й 15/00, 1980.Авторское свидетельство СССР М 1756355, кл. С 12 й 9/64, 1987. ОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДЕКСТРАНАЗЫ ретение относится к биотехнолонно к способу получения декстраз .ми к роми цетов, и может Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способу получения декстраназы иэ микромицетов. Фермент может найти применение в пищевой промышленности при переработке сахарной свеклы, пораженной слизистым бактериоэом и для приготовления профилактических средств против кариеса зубов.Целью изобретения является упрощение способа и ускорение процесса за счет сокращения сроков культивирования продуцента.Способ заключается в том, что продуцент Азрегдцз пзце(оз ВКПМ Р 342 выращивают на оптимизированной среде следующего состава в мас. (: культуральная жидкостьецсопозтос (пезептегосез ВКПМ ральн госез на 24- 30-60 спосо сти пр конце раза, проду нении тивно 1808873 А 118088733везептего 1 без беэ его предварительного мг/мл, редуцирующих веществ - 30 мг/мл, выделения и очистки. Причем используют Наряду с декстраном она содержит автоликультуральную жидкость определенного, зованные клетки бактерий, фруктозу, обраэкспериментально обоснованного состава, зовавшуюся из сахарозы в процессе а именно с содержанием декстрана от 24 до 5 синтеза декстрана, а также другие продукты 32 мг/мл и концентрацией редуцирующих жизнедеятельности бактерий 3 леземевеществ от 30 до 60 мг/мл. Кроме того, мно- гоЫез, которые могут служить дополнительгократными экспериментами установлено, ным источником углерода для продуцента что культуральная жидкость 3 везеп 1 е- декстраназы. Содержание декстрана в пиго 1 без является хорошим индуктором синте тательной среде, приготовленной на основе за декстраназы,лишь для А.1 пзцемз ВКПМ 1 лезеп 1 егоЫез составляет 0,25 о , В контР 342,рольных вариантах в качестве индукторэ исП р и м е р 1. Получение культуральной пользуют декстран в концентрации 0,25 и жидкости 3 лезептего 1 без. 0,5%.3.лезептего 1 без культивируют на пита Дестраназную активность измеряют в тельной среде следующего состава (%): КС 1 глюкозных единицах, Результаты приведе - 0,01;: 9504 7 Н 20 - 0,01; КН 2 РО 4 - 0,1; ны в табл.2.Ма 2 НРОд 12 Н 20 - 0,25; ИНЕС - 0,05; пеп- Из представленных результатов видно, тон - 0,02; дрожжевой экстракт - 0,1; саха- что грибы Реп 1 с 1111 цгп рзсаг 1 цт, Репс 31 цв роза или меласса - 10, вода - остальное. 20 1 цп 1 сц 1 озцт, Яр 1 саг 1 а чо 1 асеа и дрожжи Культивирование осуществляют в колбах 3 1 ропч 1 сез зр. накапливают максимальное Эрленмейера беэ аэрации и пер 6 Мешива- количество фермента на средах с декстрания при температуре от 24 до 26 С. Количе- ном в количестве 0,5%. На среде с культу- ство декстрана в культуральной жидкости ральной жидкостью активность гораздо определяют, осаждая его этиловым спиртом 25 ниже, Культивирование А 1 пзцевз ВКПМ Г- и высушивая до постоянного веса при 342 на питательной среде с 10% культураль ОС. Результаты опыта приведены в . ной жидкости 3 лезептего 3 без позволяет табл,1 достичь такого же уровня накопления деПредставленные в табл,1 результаты кстранэзы в среде, как при использовании в показывают, что при культивировании на 30 качествеиндукторадекстрана.среде с мелассой(отход сахарной промыш-П р и м е р 3, Культивирование А 1 пзцленности, содержащий сахарову) обрэзова- е 1 цз на средах с декстраном и культуральние декстрана идет хуже, чем на среде с ной жидкостью 3 лезепсего 1 без ВКПМ В- сахарозой, Максимальное количество пол.исахарида в обоих случаях накапливается к 35 Культивирование проводят в колбах Зр часам культивирования и составляет нэ ленмейера на качалке при температуре от сахарозе от 29,8 до 30,0 мг/мл, на мелассе 39 до 31 С в течение 4 суток на среде, содердо 17,2 мг/мл. жащей кроме индуктора следующие компоП р и м е р 2, Культивирование рэзлич- ненты (%): автол изат дрожжевой - 0,3; ных продуцентов декстраназы на питатель йайОз - 0,3; КН 2 РОа - 0,1; КС 1 - 0,05; ных средах с декстраном и культуральной М 9304 7 Н 20 - 0,05; вода - остальное, рН жидкостью 3.везепсего 1 без. 5,0-5,2. В качестве индуктора используютВ качестве продуцентов используют на- йолиглюкин или культуральную жидкость иболее активные в образовании декстрана- часовой культуры 3 лезептегоЫез, ползы культуры РепсПцв рзсаг 1 цв БИМ 45 ученную на питательной среде с сахарозой Г, Реп 1 сИПап 1 цп 1 сцозца 15, Ярсага или мелассой, Результаты представлены в ч 1 о 1 асеа ВКПМ Р 464, Азрегц 1 Ицз 1 пзцевз табл,3.ВКПМ Р 342 и 3.1 рогпусез зр Из данных, представленных в табл.З,Культивирование НроДуцентов прово- видно, что при культивировании продуцента дят в колбах на питательных средах опти на среде с полиглюкином максимальный мального для кйждого йродуцента состава, уровень активности (от 80 до 83 ед/мл) .на- В качестве Индуктора используют культу- блюдается только при концентрации этого ральную жидкость 3.лпезеп 1 его 3 без в коли-полисэхарида в среде от 0,5 до 1,0 о . Исчестве 10 о ;которуополучают,культивируя пользование в качестве индуктора культу- бактерию в течение 48 ч на среде с 10055 ральной жидкости 3,спезептего 1 без, сахарозы. Перед добавлением в питатель- полученной на среде с сахарозой, позволяет нуюсредукультуральнуюжидкостьавтокла" достичь такого уровня активности уже при вируют. Концентрация декстрана в концентрации декстрана 0,26(10 кч;ькультуральной жидкости составляет 25 туральной жидкости), Оптимальной для накопления декстраназы концентрацией10 15 20 25 30 35 40 4550 культуральной жидкости в питательной среде является 10-12;. Снижение или повышение ее содержания в питательной среде для культивирования А,1 пзцетцз приводит к уменьшению активности декстраназы. Культуральная жидкость 1.глезеп 1 его без, полученная на питательной среде с мелассой, не обеспечивает активный синтез декстраназы А,1 пзцетцз и не может быть использована в качестве индуктора,П р и м е р 4, Культивирование А пзцешз на питательной среде с культу- ральной жидкостью 1.гпезепегос 1 ез различного состава.В опытах используют полученную на питательной среде с сахарозой 48-часовую культуральную жидкость 1,пезеп 1 егос 1 ез ВКПМ В, различающуюся по содержанию декстрана (от 20 до 32 мг/мл) и редуцирующих веществ (от 30 до 100 мг/мл), Культуральную жидкость вносили в питательную среду в количестве 10;4. Результаты представлены в табл.4,Из таблицы видно, что определяющее значение имеет концентрация декстрана в культуральной жидкости, При содержании декстрана ниже 24 мг/мл декстранаэная активность в среде не достигает своего максимального значения,Концентрация декстрана от 24 до 32 мг/мл позволяет достичь уровня активности от 78,0-82,0 ед/мл, Существенное значение имеет и концентрация редуцирующих веществ(РВ), В примерах 3-7 она находится в интервале от 38 до 60 мг/мл и не влияет отрицательно на накопление декстраназы, В случаях, когда концентрация.РВ составляет от 70 до 100 мг/мл, происходит репрессия синтеза декстраназы, даже если концентрация декстрайа при этом оптимальная.П р и м е р 5, Культивирование А.пзце 1 цз ВКПМ Рв ферментере,Состав питательной среды (в мас,о ): культуральная жидкость 1.тезеп 1 егоЫез - 12 или полиглюкин - 0,5; автолизат дрожжевой - 0,3; ИаКОэ - 0,3; КН 2 Р 04 - 0,1; КС 1 - 0,05; М 9 Я 04 7 Н 20 - 0,05; воды - остальное, рН 5,0-5,2. Аэрация - 1 объем воздуха/объем среды/мин, Перемешивание - 200 об/мин, температура культивирования 30. +1. Результаты эксперимента и редставлены в табл,5. Представленные в табл,5 результаты показывают, что при использовании в качестве индуктора культуральной жидкости 1, щезеп 1 егоЫез синтез декстраназы происходит более интенсивно и максимум накопления фермента наблюдается к 42-48 часам, в то время как в известном способе максимал ьный уровень активности декст раназы - 63-80 ед/мл удается достичь эа 60-70 часов культивирования в ферментере.П р и м е р 6. Культивирование А,пзце 1 цз ВКПУ Ев колбах,Культивирование проводят в колбах Эрленмейера объемом 250 мл со 100 мл питательной среды такого же состава, как в примере 5, на качалке со скоростью 180 об/мин при температуре 30 1". Результаты приведены в табл.6,Из данных, представленных в табл,б,видно, что и при культивировании в колбах на питательной среде с к,ж, 1,везепегоЫез максимум накопления декстраназы наблюдается раньше, чем при культивировании на питательной среде с полиглюкином,Таким образом, преимуществами предлагаемого решения по сравнению с известным являются; доступность и легкость приготовления индуктора; снижение его концентрации в питательной среде в 1,5-2 раза, сокращение сроков культивирования продуцента в ферментере на 18 ч и в колбах на 12 ч при сохранении высокого уровня декстраназной активности,.Формула изобретения Способ получения декстранаэы, предусматривающий глубинное культивирование продуцента Азрег 911 цз 1 пзцетцз ВКПМ Гв аэробных условиях на питательной среде, содержащей индуктор декстраназы, автолизат дрожжевой, минеральные соли и воду, до максимального накопления активности декстраназы, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью упрощения способа и ускорения процесса за счет сокращения сроков культивирования продуцента, в качестве индуктора синтеза декстраназы и основного источника углерода используют 9-15 мас.; культуральной жидкости бактерииецсопозтос везептего 1 без ВКПМ Вс содержа- . нием декстрана 24-32 мг/мл и редуцирующих веществ 30-60 мг/мл.1808873Таблица 1 Динамика накопления декстрана при культивировании , пзезеп 1 егоМез на среде с сахарозой и мелассойаблица 2 Культивирование различных продуцентов на питательных средах с декстраном и культуральной жидкостью-581 1,гпезеп(егобез ВКблица 3 тивировэние А,пзое 1 цз на средахличнымн укторам1 О 1808873 Продолжение табл,З. Таблица 4 Культивирование А.пзоетцз на питательной среде с культуральной жидкостью лпезептегоЫез различного состава Таблица инамика накопл кости АЛпзцесоз ния активности в культуральной жидпри культивировании в ферментере12 1808873 Продолжение табл,5 Динамика накопления декстраназы при культивировании А. 1 пэце 1 ц ВКПМ Ев колбахРедактор В.Трубченко Составитель В,СоинаТехред М.Моргентал Корректор М,Петров акаэ 1258 Тираж. Подписное ВНИИПЙ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5 Произво венно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул.Гагарина,