Штамм бактерий вrаdyrнizовiuм sp. (vigna) для получения бактериального удобрения под маш

(9) 5 Е 11/08, С 12 20 ПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ ОСУДАРСТВЕННЫГЙ КОМИТЕТО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМРИ ГКНТ СССР 1(71) Всесоюзный научно-исследовательский институт сельскохозяйственной микробиологии(54) ШТАММ БАКТЕРИЙ ВВАОУЙН 20 ВЫМ ЯР. (Ч 6 ИА) ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ БАКТЕРИАЛЬНОГО УДОБРЕНИЯ ПОД МАШ Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии и биотехнологии,в частности к микробиологическим средствам повышения урожайности бобовых культурИзвестен штамм ВЫгоЫца р)азео.696, который используот для инокуляцйи .фасоли обыкновенной. Однако штамм 696не может быть использован в качестве микросимбионта маша, так как он не вступает вактивный симбиоз с атой культурой;.Целью изобретения является создание,штамма ВгабугЫгоЫце зр. для получениябактериального удобрения под маш.Клубеньковые бактерии шт. 1901 выделены из клубеньков маша.Штамм определен по определителеберги 2(57) Изобретение относится к сельскохозяйственной микробйологии и биотехнологии, в частности к микробиологическим средствам повышения урожайности бобовых культур. Целью изобретения является создание штамма В гадугЫгоЫ о и) з р, для получения бактериального удобрения под маш, Штамм бактерий ВгасугЫгоЫ 0 п) зр. (Ицпа) выделен из клубеньков маша, депонирован во ВНИИСХМ М 1901. Штамм позволяет увеличить урожай зерна маша на 3,4 ц/га или на 33,30 по сравнению с контролем. Штамм улучшает качество зерна за счет повышения в нем белка на 2,8.4 табл. Шт, Вгас 3 угЫгоЫип) зр, (Ч 9 па) 1901 депонирован в коллекции ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии под М 1901,Шт. 1901 растет на питательных средахследующего состава:1. Гороховый агар, г/л: горох 100,0; сахароза 20,0; агар 20,0; рН 6,8-7,0.2. Люпиновый агар, г/л: К 2 НРО 4 - 05;КН 2 Р 04- 0,5; Н 9304 х 7 Н 20 - 0,2; Ма С - 0,2;Са 504 - 0,1; (ИН 4)2 Мо 04 - следы; маннит -20,0; люпиновая мука - 10;0; агар - 20,0: рН -6,8-7,0.3. Маннитно-дрожжевой агар, г/л: маннит,0; К 2 НР 04 - 0,5, М 9304 х 7 Н 20 - 0,2;Ма С - 0,1; дрожжевой экстракт - 0,4 агар -150; рН - 6,8-7,0,Морфолого-культуральные свойства.Вегетативные клетки.На косом маннитно-дрожжевом агаре с .РН 6,8-7,0 при 26-28 С в пятисуточнойкультуре имеют форму слегка изогнутых палочек с закругленными концами, размер 2,4 - 3,6 х 0,7 - 0,8 мкм, грамотрицательные, до 72 ч подвижные, затем по мере старения - к 5 суткам - утрачивают подвижность, монотрихи, Медленнорастущая культура.Образование специализированных клеток.При старении культуры на люпиновом агаре с рН 6,8-7,0 и при 26-28 С в возрасте 10 сут и более образуются бактероиды ветвистой формы.Характеристика роста на плотной среде,1. Люпиновый агар, Т - 26 - 28 С, рН 6,8-7,0а) Штрих 5-суточной культуры умеренный, белый, слизистый, слабовыпуклый, блестящий.б) Колонии появляются на 7-е сутки; на 10-е сутки колонии имеют размер 1-1,5 мм, однотипные, круглые, выпуклые, с ровными краями, слизистые, Я-формы, белые.2. Маннитно-дрожжевой агар, Т -26- 28 С, рН 6,8 - 7,0а) Штрих 5-суточной культуры обильный, беловатый, стекающий,б) Колонии появляются на 7-е сутки; на 10-е сутки имеют размер 1-2 мм, однотипные, круглые, выпуклые, с ровными краями, слизистые, Я-формы, беловатые.3. Гороховый агар, Т - 26-28 С, рН 6,8- 7,0а) Штрих на гороховом агаре скудный. Эта среда используется для получения колоний,б) Колонии появляются на 7-е сутки; на 10-е сутки имеют размер 1-1,5 мм, однотипные, круглые, выпуклые, с ровными краями, слизистые, З-формы, белые.Рост в жидкой среде.Молоко с лакмусом, Т-28 С, не пептонизирует, подщелачивает. После 48 ч окраска молока изменяется в сторону синего спектра, максимальное изменение цвета отмечается на 15-е сутки.Физиолого-биохимические свойства, Симбионт,Макросимбионт-бобовое растение маш.Отношение к:а) кислороду - аэроб;б) Т максимальная 40минимальная 10оптимальная 26 - 28с) рН максимальный 8,0минимальный 6,0оптимальный 6,8-7,0Источники углерода д е Глюкоза Ащ (-) Галактоза АщСахароза АщЛактоза АщМаннит Ащ5 Сорбит АщРамноза АщКсилоза АкМал ьтоза АщДекстрин Ащ10 . КлетчаткаеКрахмалеЖидкая среда Норриса, Т - 26 - 28 СИсточники азота ЖеМай.Оз +15 (К Н 4)2504 +Тирозин " +МПААзот фиксирует в симбиозе с машем.Другие характерные физиологические20 особенности обмена,Желатину не разжижает.Штамм не патогенен.Штамм 1901 хранится на люпиновомагаре указанного выше состава, рН 6,8-7,0,25 при 4 С и пересевается один раз в 6 мес.Оценку симбиотических свойств штамма 1901:вирулентности, азотфиксирующейактивности и эффективности симбиоза проводят в условиях микровегетационных и ве 30 гетационных опытов.Вирулентность определяют по количеству и морфологии клубеньков, образованных при инокуляции маша клубеньковымибактериями.35 Азотфиксирующую активность определяют по величине активности нитрогеназы,В свою очередь нитрогеназную активностьизмеряют ацетиленовым методом (по редукции ацетилена) на интактнвх клубеньках.40 Эффективность симбиотический азотфиксации определяют по общему накоплению азота растениями на сосуд, а такжз повеличине урожая зеленой массы маша и содержанию в ней азота, который определяют45 с помощью системы Кьельтек-ауто Текатор(Швеция),П р и м е р 1. Микровегетационный опыт.В большие пробирки с 6 г стерильноговермикулита добавляют 19 мл среды Кра 50 сильникова-Кореняко, г/л; К 2 НР 04 - 1,0;М 930 лх 7 Н 20 -1,0; Саз(Р 04)2-0,2; ИН 430 з 0,024 (0,1 нормы): смеси микроэлементов поМ.В.Федорову - 1 мл (НзВОз - 5,0;(ИН 4)2 Мо 04 - 5,0; К 3 - 0,5; ИаВг - 0,5;55 ЕпЯ 04 х 7 Н 20 - 0,3; А 2(ЯОд)зх 18 Н 20 - О,З;МпЮ 4 - 0,2, Пробирки со средой стерилизуют в автоклаве. Семена маша.стерилизуют 0,5-ным раствором сулемы в течение 1мин, промывают стерильной. водой и раскладывают на увлажненные стерильной во15 25 30 35 40 50 дой бумажные фильтры в чашках Петри для прорастания. Через двое суток проростки в асептических условиях раскладывают по одному в пробирки со средой. Опыты ставят в 10-кратной повторности. Клубеньковые.бактерии для инокуляции растений выращивают на косом люпиновом.агаре в пробирках в течение 5 сут при 28 С и суспендируют в растворе микроэлементов. Через 5 сут после посева семян в каждую пробирку вносят 10 1 мл инокулюма, имеющего концентрацию 10" клеток. Растения выращивают в фитотроне при 22-24 С, Через 34 сут корни растений с клубеньками отмывают водопроводной водой и отдельно с каждого.растения помещают в реакционный флакон емкостью 50 мл, который закрывают резиновой пробкой, завинчивают пластмассовой крышкой с просверленными отверстиями. Во все флаконы через отвер- .20 стие в крышке шприцем вводят,5 мл ацетилена. Экспозицию с ацетиленом корней с клубеньками проводят при 26 С. Через.2 ч реакцию останавливают введением 2 мл реактива Несслера. Количество этилена, образовавшегося в результате восстановления ацетилена нитрогеназой клубеньковых бактерий, определяют через сутки на газовом хроматографе "Цвет 100". Величину нитрогеназной активности клубеньков, которая характеризует азотфиксирующую актив.ность штамма, выражают в микромолях С 2 Н 4 за 1 ч на 1 растение,Результаты представлены в табл.1. Данные табл.1 показывают, что бактерии штамма 1901 вирулентны на маше: они образуют на его корнях типичные для этого растения клубеньки; бактерии штамма 696 не образуют клубеньки на этом бобовом растении, т.е. они невирулентны на маше.Штамм 1901 является активным азот- фиксирующим микросимбионтом маша: нитрогеназная активность клубеньков, образованнь 1 х бактериями этого штамма на растении - хозяине, на 3 порядка выше, чем у контрольных растений и растений, инокулированных штаммом 696.Результаты микровегетационных опытов по определению общего накопления азота растениями маша, бактеризовэннымивышеупомянутыми штаммами, представлены в табл,2. Как показывают данной этой таблицы, в результате активной фиксации атмосферно-.го азота клубеньковыми бактериями штам ма 1901 в симбиозе с машем улучшалась обеспеченность растений азотом, благадаря чему общее накопление азота в них было на 374,7% выше, чем при использовании штамма 696. При этом урожай зеленой мэасы растений, инокулированных штаммом 1901, повысился на 56,64, а содержание азота в ней на 1,46%.В растениях, инокулированных штаммом 696, симбиотическая фиксация азота атмосферы отсутствовала, растения дополнительно не снабжались азотом из воздуха, в результате продуктивность маша в этих вариантах не увеличивалась.Приведенные материалы свидетельствуют о том, что активная симбиотическая азотфиксация у маша может быть получена только при инокуляции специфичными для него штаммами клубеньковых бактерий. Ввиду этого в дальнейшие опыты известный штамм не включался,П р и м е р 2, Вегетационные опыты проводят в сосудах с 6 кг дерновоподзолистой почвы с внесением солей по прописи Прянишникова, г/кг почвы: КС - 0,15; М 9504 - 0,06; СаХРО 4 - 0,172; МпЯО 4 - 0,003; борная кислота - 0,008; ЙН 4)2 УоОд - 0,001; МН 4 МОз - 0,024 (0,1 нормы). Повторность опыта 4 кратная. Использовали семена маша сортообразца из Узб,ССР (Коллекция ВИР) с машем.Для инокуляции семян чистую культуру бактерий выращивают на скошенном люпиновом агаре в течение 5 сут. Культуру в пробирках с титром 4 - 6 млрд. кл смывают водопроводной водой, затем суспензию наносят на семена маша, разложенные в лунки, сделанные в почве каждого сосуда, В сосуд вносят 10 кл.вДанные влияния инокуляции маша штаммом 1901 на его продуктивность приведены в табл,3. Из этой таблицы следует, что штамм 1901 вступает в эффективный симбиоз с машем, усиливает у него процесс симбиотической азотфиксации и благодаря этому свойству способен увеличивать продуктивность растения-хозяина: урожай зеленой массы. повышается на 128,1%, содержание белка в растениях на 11,2%. П р и м е р 3. Получение препарата иа основе штамма 1901.Приготовление жидкой посевной культуры,Жидкую культуру выращивают нэ качалке в качалочных колбах и пятилитровых бутылях в течение 3 - 4 суток на среде следующего состава (мас.%): гороховый отвар - 10,0; глюкоза - 0,5; сахар пищевой - 0,5, (КН 4)2504 - 0,05; КН 2 РО 4 0,05; К 2 Н РО 4 хЗН 20 - 0,05; М 9304 х 7 Н 20 - 0,02; СаСОз стерильный) - 0,03; вода водопроводная - остальное. рН после стерилизации6.,3-6,6, Среду стерилизуют при 1 атм 30 мин. Титр бактерий 4-5 млрд/мл,Посевную культуру используют для получения жидкой. рабочей культуры. Ее готовят в пятилитровых бутылях или ферментаторах на среде следующего состава, мас, : кукурузный экстракт,0; пекарские дрожжи (влажные) - 0,05; меласса -1,0; глюкозаа - 0,5; (И Н 4)2304 - 0,1; КН 2 РО 4 - 0,025; К 2 Н РО 4 хЗН 20 - 0,25; М 9304 х 7 Н 20 - 0,02; СаСОз - 0,1; вода водопроводная - остальное; рН после стерилизации 6,2-6,5.Бутыли и ферментаторы засевают посевной культурой клубеньковых бактерий в количестве 5%. Бутылки встряхивают на качалке в течение 72-96 ч. В ферментаторах бактерии выращивают в течение 36-48 ч при ступенчатой аэрации 0,2 - 0,1 об/мин под избыточным давлением 0,3-0,5 атм при 28- 30 С. Титр не менее 5 млрд/мл. После микробиологического контроля культуральную жидкость из бутылей и ферментаторов - инокулюм - используют для смешивания с торфом.Подготовка торфа,Размолотый низинный торф, нейтрализованный мелом до рН 6,8 - 7,0 с влажностью 30-40 в полиэтиленовых пакетах по 200- 400 г, стерилизуют гамма-облучением при дозе 2,5 Мрад. Стерильный торф в пакетах инокулируют иньекцией смеси: Культуральная жидкость+ меласса (3%) из расчета исходного титра бактерий в торфе 0,15-0,8 млрд/г торфа и влажности 45-60%. Затем пакеты загружают в специальные смесители, при вращении которых перемещается их содержимое, Ризоторфин хранят при 10- 15 С в темном сухом помещении отдельно от ядохимикатов,Характеристика готового продукта.Ризоторфин для маша на предлагаемом штамме представляет собой по внешнему виду увлажненную сыпучую массу темного цвета без запаха, нерастворимую в воде. Влажность готового продукта 50 - 55%. Ризоторфин содержит 3-4 млрд бактерий в 1 г торфа. Срок годности препарата 6 мес со дня изготовления. Расход препарата 200 г на гектарную норму семян.П р и м е р 4, Конкретное использование штамма 1901 в полевых условиях.Эффективность симбиотической азот- фиксации штамма 1901 определена в полевом опыте по величине урожая зерна и содержанию в нем белка. Почва опытногоучастка - орошаемые сероземы, площадьделянки 10 м; повторность опыта 4.кратная.Вносили минеральные удобрения РбоКво.5 Использовали семена маша. Семена обрабатывали ризоторфином, изготовленным наоснове штамма 1901.Доза препарата 200 г на гектарную норму семян, титр. препарата 3 млрд/г. Способ10 внесенияпрепарата:200 гризоторфинаразводят в 1 л водопроводной воды и, не даваясуспензии отстаиваться, наносят ее на гектарную норму семян. Затем семена тщательно перемешивают для равномерного15 распределения препарата. Обработанныеризоторфином семена высевают в тот жедень во влажную почву.Штамм 1901 является видеоспецифичным по отношению к машу, по сравнению с20 ранее описанным, т.е. известный штамм невступает в эффективный симбиоз с машем.Поэтому в полевом опыте было лишь дваварианта: контроль, где растения могли инфицироваться природной популяцией ризо 25 бий и вариант с инокуляцией штаммом 1901(табл.4).Данные табл.4 показывают, что штамм1901 является высокоэффективным симбиотическим азотфиксатором, Улучшение азот 30 ного питания инокулированных растениймаша сортообразца из УЗССР (КоллекцияВИР) за счет более интенсивного поступления биологического азота оказывает положительное влияние как на урожайность35 растения-хозяина, так и на его качество,Урожай зерна маша при бактеризации этимштаммом повышается на 3,4 ц/га или на33,3%. Штамм улучшает качество зерна засчет повышения содержания в нем белка на40 2,8%,Таким образом, штамм ВгабугЫгоЫшазр. (Ицпа) 1901 существенно увеличиваетазотфиксирующую способность маша, пои ы шает его урожай и улучшает качество уро 45 кая эа счет увеличения в нем белка. Этоуказывает на то, что штамм является активным азотфиксирующим микросимбионтоммаша и может быть использован для получения бактериального удобрения.50Формула изобретенияШтамм бактерий ВгабугЫгоЫоа эр.(Ицпа) ВНИИСХМ 1901 для получения бактериального удобрения под маш.101712348Таблица 13Вирулентность и азотфиксирующая активность штаммов 1901 и 696.Таблицтивность симбиотической ээотфиксации штаммов 190696.блицаивность симбиоза штамма 1901 маш12 1712348 Таблица 4 Эффективность штамма в полевом опыте с машем Составитель С. ЛевинТехред М.Моргентал ректор Л, Патай едактор В. Трубчен ака одственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул. Гагарина, 10 7 Тираж ПодписноеИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/б