Способ получения сукралозы

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК 119) (И) 590 51)5 С 12 Р 19/20, С 3/04/ ПИСАНИЕ ИЗОБРЕ ЕНИЯ К ПАТЕН ан Ф 10 аблик Ли оун, Кхи ед Кхан, Эндрю Дж Дордик ( итед (С ар Сулетер Са н ХэВ) итании Кф 207974блик. 1982.(54) СП (57) Из СОБ ПОЛУЧЕНИЯбретение отноЦель изобретэа счет ииними СУКРАЛОЗЫится к биоте нологии процесс ния - упрощение эации образо нии хлориророзы ТХР (Р оксигалакто хлор-дезо ,-Р,б-дихл фуранозида) ОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИРИ ГКНТ СССР(71) Тейт энд Лайл (72) Элнер Брин Раттан Мафти, Риаз Ахммюэл Джеймс Читхэм,кинг и Джонатан Сег (53) 547.813 (088.8(56) Патент Великобкл. С 07 Н 3/04, оп Изобретение относится к биотехно логии, представляет собой получение сахаристого продукта с высоким,подслащива щим действием - сукралозы 14,1 -б-трихлор-1,6-тридеоксиг лактогахароза, известная под обозна чением ТГС (ТОК, которая примерно в 600 раз слаще сахарозы.Цель изобретения - упрощение про цесса путем минимизации образования обочных продуктов, Способ заключается в инкубироваанного производного са створ 0-Ь-Р-хлор-д пиранозил-(1-6) - -Р- силактопиранозил-(1-2) ор,б-дидезоксифрукто в присутствии фермента вания побочных продуктов. Хлорзамеценный сахар 0-Я;Р-хлор-дезоксигалактопир оэил-(1 -6)-0-Р-хлор 4-дезоксигалактопирапоэил-(1 р 2)-15 Р,6-дихлор,6-дидеэоксифруктофуранозид (ТХР) используют для получениясукралозы в результате инкубированияТХР в растворе в присутствии 0-галактозидаэы, служащей для удаления6-хлор-дезоксигалактозильного остатка из положения 6, в частности энзима, получаемого из МогСдеге 11 а ч 1 пасеа, Сдгс 1 пе 11 а шизсае. ТХР получают в результате обработки рафиноэыхлористым тионилом в присутствии окиси трифенилфосфина. Раствор представляет собой водную систему или несмешиваемый с водой гидрофобный растворитель. 1 э.п. ф-лы, 2 табл. лужащего для удаления 6-хлор-дезо игалактоэильного остатка из полож ния 6. Особый интерес представляют гал тозидазы. Мелибиозы представляют гораздо меньший интерес вследствие того, что) хотя мелибиоза (ОР-галактопиранозил-(1 - ъ 6)-0-Р-глюкопираноза) представляет собой компонент рафинозы, но хлорированная ТХР имеетобращенную конфигурацию. Найдено, чтомногие иэ указанных энзимов не обладают. какой-либо полезной активностьюв отношении ТХР даже в тех случаях,когда они способны высвобождать сахароэу из рафиноэы. Исследовано около20 энзимов ряда К-галактозидаз, полученных из бактериальных, грибковых, 1635905и растительных источников, однако только 8 из них обладали активностью в отношении гидролиза ТХР, причем все они происходили из грибковых источников. Активными энзимами были полученные из штаммов Могг.деге 11 а чЫасеа, С 1 гсгпе 11 а шцзсае. Наиболее активным является Моггдеге 11 а ч 1 пасеа,разновидности га 11 гпозецд 1 гкег (АТСС Р 20034), поставляемой фирмой "Хоккайдо Шугар Компани". Скорость реакции с участием ТХР в этом случае составляет лишь несколько процентов от скорости реакции с участием самой рафинозы. Однако, принимая во внимание значительные конформационные и конфигурационные различия между рафинозой и ТХР, даже эта скорость (или активность) является неожиданной и приводит к практически полному гидро- лизу ТХР в сукралозу.Гранулированные клетки М.чдгасеа разновидности гаГГдпозеыгд 1 дкег используются при производстве свекловичного сахара с 1968 г.Энзиматическую обработку удобно осуществлять в водном растворе. Однако, хотя для осуществления реакции требуется присутствие воды, обнаружено, что-галактозидаза может интенсивно гидролизовать ТХР в сукралозу и в ряде органических растворителей, Установлено, что энзим является наиболее стабильным и активным в несмешивающихся с водой органических растворителях, тогда как ТХР хорошо растворяется только в гидрофильных растворителях, Таким образом, наиболее подходящими растворителями для гидро- лиза ТХР являются гидрофильные несмешивающиеся с водой органические растворители, например этилацетат, н-бутанол и метилизобутилкетон. Так, например, скорость гидролиза ТХР, определенная по числу обращения катализатора (К щ в ,) в этилацетате, предварительно насыщенном водным буфером (который дает достаточное количество воды для гидролиза), аналогична скорости гидролиза в водном буфере. Предполагается что энзим сохраняет полную каталитическую активность и в том случае, когда он суспендирован в органическом растворителе. Каждый из укаэанных органических растворителей, будучи предварительно насыщенным водным буфером, остается в виде единой органической фазы. Энзим функциониру 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 ет в органической фазеГидрофильныенесмешивающиеся с водой растворители(например этилацетат, н-бутанол и метилизобутилкетон) оказались способными поддерживать высокую каталитическую активность и высокую растворимость ТХР.В табл. 1, приведены данные растворимости при 55 С ТХР и сукралоэы в (различных растворителях (все онипредварительно насыщались водным буфером) по сравнению с водным буфером,Совершенно ясно, что растворимость ТХР становится максимальной в случае использования гидрофильных несмешивающихся с водой растворителей.К числу прочих преимуществ проведения процесса гидролиза в органической среде относится также увепичение термической стабильности (стабильность 0-галактозидазы при 55 С вй этилацетате примерно на 50 Е выше, чемв водном растворе) и растворимости субстрата (растворимость ТХР в указанных выше растворителях составляет свыше 503 (мас/объем), тогда как в водном буфере растворимость ТХР составляет только 15 Ж (мас/объем .В случае использования как водных, так и органических систем обработку следует проводить при оптимальных значениях температуры и рН для данного энзима, которые в случае использования О(-галактозидазы М.чЫасеа составляют примерно 55 С и рН = 4,5-5,5. В органических растворителях, насыщенных водным буфером, эти значения рН относятся к рН водного буфера. При указачной температуре и рН = 5,0 обнаружено, что получаемая сукралоза не подвергается распаду.Энзим можно растворить или диспергировать в водной системе в виде экстракта, не содержащего клеток, получаемого, например, в результате обработки гранул ультразвуком, или же можно использовать его в иммобилизованном виде, например в виде гранул, помещенных в колонны или расположенных слоями. В органических системах энзим остается в нерастворимой форме и может быть повторно использован в слоях или колоннах.Отделение получаемой в качестве продукта сукралозы осуществляют любым известным способом, например путем испарения и экстракции в органи,ческом растворителе, применения хроматографических методов, селективнойкристаллизации из водных или неводных систем.П р и м е р 1. Получение сукралозы в водном растворе (в микроколичествах) .Тетрахлоргалакторафинозу в количестве 20 мг помещают в завинчивающий 10ся сверху сосуд, содержащий 2 мл0,1 М цитрат-фосфатного буфера (рН= 5,0). Получают раствор концентрацией 1 7. (мас/объем) . Указанное коли"чество воды поддерживается постоянным15в процессе последующего инкубирования путем добавления необходимого ееколичества тогда, когда это потребуется.К смеси добавляют 10 мг М-галактозидазы в форме гранулированных клеток Мог 11 еге 11 а ч 1 пасеа разновидностигаГЕЫозеиг.11 1 гег АТСС Р 20034 (поставляется фирмой "Хоккайдо ШугарКомпани", Япония), и инкубируют полученную смесь в течение 100 ч при 55 С.Периодическое наблюдение за степеньюгидролиза осуществляют, используя метод тонкослойной хроматографии, длячего из реакционной смеси отбираюталиквоты по 250 мкл, которые элюируютсмесью этилацетат:этанол:вода (45:5::1), или метод жидкостной хроматографии под высоким давлением на колонке"Уотерс Декстропак С 18" с обратнойфазой, применяя для элюирования 20". - 35ный ацетонитрил (объем/объем). Содержание продуктов измеряют с помощьюдетектора, основанного на определениипоказателя преломления. Полученные результаты приведены на фиг.1. Так, было найдено, что примерно 537 продуктапрогидролизовано спустя 48 ч и примерно 702 - спустя 90 ч. Продукты разделяют хроматографическим способом,причем помимо сукралозы обнаруженыб-хлоргалактоза и ТХР. В этой системеТХР можно использовать в количестведо 157 (мас/объем). В водном раствореданный энзим имеет константу Михаэлиса (К), равную 5,8 мм, и константу50Клодтравную 52,5 мг на г энзима вчас,П р и м е р 2. Гранулы Моггеге 1- 1 а ч.пасеа разновидности гаГГдпозецгд 11 яег (АТСС Н 20034) в количестве 3 г гидратируют в 0,1 М растворе цитрат-фосфатного буфера (рН = 5,0), содержащего 57 (мас/объем) рафинозы,05 6и заполняют смесью колонку размерами 11"0,9 см с объемом слоя 7 см, обо рудованную водяной рубашкой, В указанной колонке поддерживают температуру, равную 55 С, с помощью циркуляционного водяного насоса. При использовании указанной колонки для гидро-.лиза ТХР в сукралозу было найдено, что время полупревращения (до 502 конверсии) составляет 13 сутокП р и м е р 3. Микроорганизмы, пригодные для осуществления гидролиза ТХР в сукралозу..Микроорганизмы, обладающие активностью в качестве о(-галактозидаз, получены из коллекции культур АТСС. Их выращивали в колбах емкостью 100 мл, содержащих среду на основе минеральных солей 1 г/л экстракта дрожжей и 5 г/л рафинозы, встряхивая при температуре 30 С.Клетки отбирают посредством центрифугирования (5000 об/мин при центрифугировании в течение 10 мин) в поздней экспоненциальной стадии роста, повторно суспендируют в пятикратном количестве от объема цитрат-фосфатного буфера при рН = 5,0 и выдерживают при 0 С на бане со льдом, после чего разрушают посредством 3 прогонов по 20 с в ультразвуковом устройстве (" Дэйв Сонипросб", тип 1130 А) при максимальной мощности. Полученную при этом суспензию центрифугируют при 17000 об/мин в течение 30 мин и исследуют на наличие активности в качестве -галактозидазы (как осадок, так и верхний слой), определяя указанную активность в единицах на 1 г сухой массы клеточного остатка и применяя для этой цели и-нитрофенил-ф- Э-галактопиранозид (фирмы "Сигма" ). В поверхностном слое не обнаружено практически никакой энэиматической активности. Для культур, которые дают положительные результаты при испытании на гидролиз ТХР согласно способу, описанному в примере 1, получаемые результаты (см. табл. 2) приводятся в мг сукралозы, полученной на 1 г сухой массы клеточного остатка в час (для 70 -ной конверсии). П р и м е р 4. Получение сукралозы в органической среде.ТХР в количестве 23 мг помещают в пробирку 5 мл с завинчивающейся пробкой и добавляют 2 мл органического1635905 Пример 5,Концентрация ТКР еначале реакции, 2 1 О 5 2,5 1 0,5 Концентрация аиаима, 2 25 1,25 0,5 0,25 2 наличной сукралоеи череа ч; 0,3 02 0,08 06 0,4 1,17 0,05 0,025 0,11 0,065 0,22 0,135 0,38 0,22 0,33 23 0,75 О,Э 3 1,55 0,85 0,580,88 72 Пример 6. Концентрация ТКР в 1 ачалереакции, 2 1 О 1 О 5 55 0,5 2,5 0,5 Концентрация аианма 2 2 наличной сукралоам череа ч: 029 01 0,08 О,2 0 18 0,65 0,12 1,4 22 2,4 0,4 155 037 31 2,7 215 0,540,8 0,50 7 О 0,74 растворителя, предварительно насыщенного водным буфером (ацетат натрия 50 мИ, рН = 5,0), получая в результате.20 мМ (1,153 мас/объем) раствор. В каждую из пробирок добавляют по 100 мг К-галактозидаэы в форме гранулированньм клеток М.чдпасеа разновидности гаГГ 1 позеп 11 дкег АТСС У 20034, после чего инициируют проте О кание реакции путем введения 17 (объем/объем) водного буфера, интенсивного перемешивания в течение 30 с и помещения пробирки в водяную банюосо встряхиванием при 55 С и 100 об/мин.15 Периодически из реакционной смеси от- бирают пробы по 25 мкл, которые вводят в систему хроматографического анализа при высоком давлении (система с использованием обратной фазы, колонка "Уотерс Декстропак С 18"), используя для элюирования 207-ный водный раствор ацетонитрила и измеряя количество полученной сукралозы и остаточной ТХР. Эффект наличия органы" 25 ческого растворителя при получении сукралозы в течение 24-часового инкубирования приведен на фиг.2, Зависимость степени гидролиза ТХР в сукралозу от времени приведена в виде кривой 1 для водного буфера и для трех растворителей: метилизобутилкетона (кривая 2), этилацетата (кривая 3) и н-бутанола (кривая 4). Протекание реакции гидролиза в метилизобутилкетоне и водном буфере одинако"во, в случае использования этилацетата и н-бутанола зафиксированы болеенизкие скорости протекания реакции иконверсии. Во всех случаях наблюдается свыше чем 507-ная конверсия запромежуток времени, равный 24 ч,прн конверсии за тот же промежуток времени,равной 703, для водного буфера и метилиэобутилкетона.,В отдельном опыте определяли в кинетические параметры . энэима по Михаэлису-Иентену как для водного буфера так и для этилацетата, К 6 и К ко в этилацетате равны соответственно 16,4 рИ ТХР и 56,3 мг сукралозы/г 7 гранул/ч, Причиной того, что временной график для процесса гидролиза ТХР в этилацетате находится ниже, чем соответствующий график в водном буфере (при 20 ьИ ТХР), является более высокое значение К 14 ТХР в этилацетате, а не меньшая каталитическая активностьПри использовании 50 мМ ТХР скорость и степень конверсии при гидролизе ТХР в этилацетате аналогичны соответствующим величинам в водном буфере.(О 2 18,6 20431 43,7 22618 20,8 Аярегд 111 а аюашог 1 44733 П р и м е р 7. Гранулы МогСдеге 1- 1 а ч 1 пасеа чаг гаГГ дпояеиг 11 дяег АТСС 20034 в количестве 12,5 г гидратируют в растворе 0,1 М цитрат-фосфатного буфера, рН 5,0, содержащего рафинозу 2,5% на объем, и заполняют ими колонку 5,7 см с объемом насадки (есч) 27 мл поддерживая температуру 55 С с помощью водяной рубашки, снабженной циркуляционным насосом. Через колонку пропускают 2,5%-ный на объем водный раствор ТХР с начальной скоростью потока 0,11 есч/ч, которую снижают до 0,09 есч/ч через 13 дней и до 0,038 есч/ч через 26 дней, что дает около 19 н сукралоэы через 28 дней (65%-ная конверсия). Половинный распад энзима достигается в период между 25 и 30-м днями. Формула изобретения 1. Способ получения сукралозы, предусматривающий хлорирование производного сахарозы, замещенного в положении 6, с введением атомов хлора в положение 4, 1 и 61 сахарозы и последующее удаление 6-заместителя, отличающийся тем, что, с целью упрощения процесса эа счет минимизации образования побочных продуктов, в качестве 6-замещенного производного сахароэы используют рафиноэу, а удаление 6-заместителя осуществляют путем ферментативного гидролиэа 1-15%-ного раствора О-М-Р-. хлор-дезоксигалактопиранозил-(1-6)- М-П-хлор-дезоксилактопиранозил- (1-2)Р,6-дихлор,6-дидеоксифруктофуранозида в водной системе или в гидрофобном растворителе с использованием "галактозидазы из Иогг 1 еге 11 а чдпасеа или Сгс 1 пе 11 а шцясае, проявляющей степень гидролиза от 1,6 до 4,3 мг сукралозы на 1 г сухого клеточного остатка в 1 ч при 30 60 ОС до достижения 50-70%-ной конверсии.2. Способ по п.1, о т л и ч а ю - щ и й с я тем, что растворитель представляет собой метилизобутилкетон, этилацетат или н-бутанол(1,0 0 21,3 Хоккайдогранулц 4,3 Составитель И.Приваловаедактор А Маковская Техред М.Дидык Корректор М,Самборская ГКНТ СССР рстве11 ательский комбинат "Патент", г,ужгород, ул, Гагарина, 101 иэводственн каэ 763НИИПИ Го Авреге 111 а пдвуС 1 гсдпе 11 а вивсае Бас сЬа гошусев ъапппа 1 агощусев ЬепворЬ 1 цвМогтдеге 11 а ч 1 пасеа О О 40 Юфем иеуйрайнРие. 1 Тираж 361ого комитета по иэобретен 35, Москва, Ж, Раушска Подпис ное м и открытиям наб., д. 4/5