Способ определения количества микроорганизмов в почве

(И) 504 С ЗОБ ПИСАН ТЕН втоРСНОМч 7. Бюл, В 11 М.В.Ломоносова емова, Н.С.Паник.8)биол вягинце о ез. Совр.223 ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ(56) Методы почвенной микрои биохимии,/ Под ред.,Д,Г,Зва, - МГУ, 1980, с. 17.Аозпюз. - Вц 11.Есо 1. Кпшп. БосКЬо 1 щ, 1973, ч, 17 234.Перт Дж, Основы культивированиямикроорганизмов и клеток. - М.: Мир,1978, с. 30,(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОЛИЧЕСТВАМИКРООРГАНИЗМОВ В ПОЧВЕ(57) Изобретение относится к области микробиологии. Целью изобретенияявляется повыщение точности способа. Непосредственно в почве измеряютколичество микроорганизмов по скорости протекания микробиологического процесса. Для этого в почву вносят субстрат, ассимилируемый микроорганизмами. Химическая природа субстрата. диктуется задачей исследования, т.е,. тем, количество каких микроорганизмов требуется определить./Для определения биомассы денитрифици рующих микроорганизмов в образец сочвы вносят нитрат калия, для нитрификаторов - сульфат аммония. Количество вносимого субстрата составляет 0,5-2,5 мг/г почвы. Продолжительность выращивания микроорганизмов зависит от удельной скорости их роста и составляет 5 - 96 ч. В исследуемые образцы почвы вносят субстрат и инкуо бируют при 25 С в ультратермостате. В процессе инкубирования измеряют скорость потребления субстрата. Рассчитывают метаболический коэффициент (Ч) по формуле 1 Л 61 пЧ:йе, где Ч - скорость потребления субстрата; 7 - экономический коэффициент; д С - время инкубации. Разделив величину скорости потребления субстрата в начальный момент после внесения его в в почву на величину метаболического коэффициента, получают величину биомассы микроорганизмов г исследуемом образце почвы. Способ позволяет определять не условные, а абсолютные значения микробной биомассы, выявляет только жизнеспособные и метаболи." чески активные микроорганизмы. Рост микроорганизмов протекает непосредственно в почве, т.е. в естественных условиях, что гарантирует точность и полноту учета, 5 табл..Я - концентрация субстрата;и - максимальная удельная скорость микробиологического процесса;Кш - константа насыщения;численно равная той концентрации субстрата, при которой Ч=0,5 чмаиеПри внесении в почву насыщающих концентраций субстрата (Я ) К) уравнении (1) упрощается 35 40 Ч=1 Х Чо Ч(2) 45 где Ч - скорость потребления субстрата в начальный момент после внесения его в почву,мг/ч г почвы;в . пересчетный коэффициент,удельная скорость метаболизма, мг субстрата/ч мг биомассы.Для измерения о определение Ч проводят один раз с известным количеством микроорганизмов, это количество устанавливают весовым методом путем микроскопического подсчета клеток И Тде 2982Изобретение относится к почвенной микробиологии и может быть использовано для оценки микробиологических Факторов плодородия почвы, эффективности действия бактериальных удобрений, при санитарно-гигиеническом обследовании природных объектов.Цель изобретения - повышение точ-ности способа путем измерения количества микроорганизмов (биомассы или численности клеток) по скорости протекания микробиологического предела непосредственно в почве.На основании изучения особенностей кинетики роста микроорганизмов в почве разработан прием прямого определения коэффициента пересчета величины скорости процесса и величины микробной биомассы или численности.20Скорость Ч превращения микроорганизмами подавляющего большинства экэогенных субстратов зависит от их концентрации и от количества микроорганизмова Я ХЧ= --- (1)КЯ 46Применительно к почве нахождение ц подобным образом невозможно, так как истинные размеры микробной биомассь в почве неизвестны, а внесенные в почву микроорганизмы не тождественны эндогенной микрофлоре.Это диктует необходимость нахождения величины Ч для каждой конкретной ситуации, Прием нахождения ц заключается в прослеживании динамики нарастания скорости потребления субстрата в процессе роста микроорганизмов и расчета по формуле:где р - удельная скорость роста мик-,роорганизмов;у - экономический коэффициент,выход биомассы на единицу потребленного, мг биомас. сы/мг субстрата;- время инкубации.Для экспериментального определения 1 достаточно получить данные по динамике нарастания Ч в первые часы или сутки после внесения в почву субстрата. Величина У представляет собой для данной Физиологической группы относительно постоянную величину, например: для микроорганиэмов 1 использующих глюкозу у,ц , 0,6 гС = биомассы/гС-субстрата: для нитрификаторов У, = 0,7 ф 10 клеб ток/мкг И; для денитрификаторов У,ц2,67 г сухого веса биомассы/г 11; величину у находят по справочным данным для каждого конкретного случая, либо определяют экспериментально, исходя из соотношенияС 1 ХдЯСогласно предлагаемому способу в почву вносят субстрат не только для измерения Ч, но и для того, чтобы микроорганизмы, иапользующие данный субстрат, работали по экспоненциальному закону:Х=Х ехр Ь(Т-)где ь - продолжительность лаг-перио-,да.Условия, необходимые для реализации экспоненциального роста микроорганизмов:в почву вносится субстрат, ассимилируемый микроорганизмами, метаболи 12982эируемый, но не дающий прироста количества клеток субстрат (подобный тетразолиуму и .прочим ксенобиотикам) применяться не может, химическая природа ассимилируемого субстрата дик" туется задачей исследования, т.е, тем, количество каких микроорганизмов требуется определить;количество вносимого субстрата Б, должно многократно превышать констан-Оту насыщения микроорганизмов Кэ (10 М для большинства видов) и обеспечить нелимитированный рост на протяжении по крайней мере 0,3-3 генераций (5-96 ч). Расчет величины осу ществлякт по формуле где Х, - предполагаемое количество микроорганизмов в почве; 20 п - число генераций.На практике численное значение Х 11трудно оценить заранее, но эмпирически установлено, что для обеспечения 0,3-3 генераций микроорганизмовв почву достаточно внести 0,52,5 мг/г субстрата, являющегбся источником энергии;продолжительность выращивания микроорганизмов зависит от удельной скорости их роста или времени их генерации. Чем выше р, тем короче срокинкубации. Практическим критериемдля выбора срока инкубации являетсяследующий: величина Ч должна достоверно возрасти по сравнению с Ччисленным значением Ч в момент внеисения субстрата в 1,2-12 раз. Эквивалентная форма рекомендации по установлению срока инкубации: 0,3-3 времен генерации микроорганизмов или5-96 ч.П р и м е р 1, Определение био-,массы микроорганизмов, способныхиспользовать глюкозу,5 г дерново-подзолистой почвы помещают в пенициллиновый Флакон, вносят 12,5 мг глюкозы в виде концентрированного раствора, закрывают герметично резиновой пробкой и инкубируют при 25 фО, С в течение 30 мин.После этого отбирают шприцем пробувоздуха, измеряют в ней концентрацию СОг на газовом хроматографе иснимают резиновую пробку с флакона.В течениепоследующих 30 мин Флаконинкубируют без пробки при той же0температуре 25 С, затем флакон закры 46 4вают пробкой еще раз на 30 мин и повторяют измерение скорости образования СО , после чего инкубируют 30 минбез пробки и т.д. Всего приводят пятьизмерений скорости образования СОгчерез каждый час. Результаты определений сведены в табл.1.ПпЧПо формуле п = --- находят среднеейГзначение ш = 0,021 ч . Величину Упринимают равной 0,67 г СОг-С/г С би-.омассы, Отсюда находят Ч=0,014 мкгС/мкг С биомассы и биомассу микроорганизмов, способных расти на глюкозе, 355 мкг С/г почвы.П р и м е р 2, 5 г типичногомощного чернозема помещают в пенициллиновый Флакон, вносят 12,5 мг глюкозы в виде концентрированного растворра, закрывают герметично резиновойпробкой и инкубируют при 25 фО, Стечение 30 мин. После этого отбираютшприцем пробу воздуха, измеряют в нейконцентрацию СО на газовом хроматогграфе и снимают резиновую пробку сфлакона. В течение последующих 30 минфлакон инкубируют беэ пробки при тойо,же температуре 25 С затем Флаконзакрывают пробкой еще раз на 30 мини повторяют измерение скорости образования СОг, после чего инкубируют30 мин без пробки и т.д. Всего проводят пять измерений скорости образования СОг через каждый час. Результаты определений приведены в табл,2.Результаты вычислений: в =0,03 чи = 0,0201 мкг С/ч мкг С биомассы,биомасса микроорганизмов 299 мкг С/гпочвы.(125 мкг В/г) и инкубируют при 25 Св течение 3 сут. Периодически отбирают пробы почвы (1 г) и определяютостаточное содержание аммония среактивом Несслера в солевой (КС 1)вытяжке. Результаты определения приведены в табл.3.Результаты вычислений:=1,25 сут, Величину У, принимают равной 0,7 л610 клеток/мкг . Величину биомассы нитрификаторов рассчитывают по формуле (2):Х = 2,66 1 О клеток/г почвы или 0,35 мкг С биомассы/г почвы.П р н м е р 4. Определение биомассы денитрифицирующих микроорганизмов.100 г чернозема южногопомещают в вакуум-эксикатор и инкубируют при 20 С в атмосфере чистого азота с 5 нитратом калия. Количество вносимого субстрата денитрификации 2,5 мг/г почвы (340 мкг Ю/г) время инкубации 4 сут (96 ч). Сразу после внесения соли, а также на 1-4 сут инкубации 1 О отбирают пробы почвы по 1 г и определяют в них остаточное содержание Юз с дисульфофеноловой кислотой. Результаты определения приведены в табл,4. 15Удельная скорость роста микроорганизмов ш в среднем равна 0,01 ч учитывая, что экономический коэффициент для данной физиологической группы микроорганизмов 7=2,67 г био массы/г азота, получают величину с 1 = 3,7410 мкг В/ч мкг биомассы. Количество биомассы денитрифицирую" щих микроорганизмов равно 0,92/3,74 х х 10нли 256 мкг, 25П р и и е р 5. Определение проводят по примеру 4, но с внесением в почву 0,5 мг/г нитрата калия (69 мкг Б/г почвы), время иикубации 5 ч. Результаты определения приведе ны в табл,5.Результаты расчета: =0,094 ч Ц3,525 10 мкг Ы/ч мкг биомассы, Х " 238 мкг.П р и м е р 6, Определение количества микроорганизмов в почве методом посевов.1 г дерново-подзолистой почвы растирают в фарфоровой ступке, заливают 100 мл стерильной воды, диспергируют 40 иа ультразвуковом деэинтеграторе (0,2 А, 2 мин) и готовят серию разведений в стерильной воде (1 О , 10 10 ) 0,05 мл из каждого разведения наносят на поверхность агаризо ванной среды (ИНА, бульон, предварительно разбавлен в 10 раз), разлитой в чашки Петри. После 7-суточной инкубации прикомнатиой температуреподсчитывают количествовыросших колоний. Ре6эультаты учета 3,810 клеток/г почвы,Аналогично проводят определение количества микроорганизмов в образце типичного мощногочернозема. Ре 6эультаты учета 3,1 10 клеток/г почвы.П р и м е р 7. Определение биомассы клеток по скорости восстановления красителя тетразолиума. 10 г дерново-подзолистой почвыпомещают в коническую колбу, вносят О мл Х-ного раствора трифенил.тетразолийхлорида (ТТХ) в 0,1 Итрис-НС буфера рН 7,6. Суспензиюперемешивают иинкубируют в анаэростате (разрежение 1 атм) при 37 С втечение 2 ч. Затем в колбу вносят1 О мл экстрагента (смесь ацетона,СС 1 и этанола в соотношении 7:2:1),встряхивают, фильтруют через бумажный фильтр и измеряют оптическуюплотность на спектрофотометре при546 нм. По калибровочной кривой, связывающей оптическую плотность раствора с концентрацией формаэанов (Ф)находят скорость реакции восстанов-.ления красителя 35 мкг Ф/ч г почвы.Аналогично проводят определениес образцом типичного мощного, чернозема. Результаты определения150 мкг Ф/ч г почвы.Таким образом, применение известного способа (пример 7) позволяет получить лишь условные величины микробной биомассы в единицах ферментативной активности - так называемая дегидрогеназная активность почв (ДА),оВ черноземе ДА в 4 раза выше, чемв дерново-подзолистой почве, т.е.чернозем содержит в 4 раза большемикроорганизмов. Однако метод посева выявляет приблизительно равноеколичество микроорганизмов в двухисследованных почвах.Предлагаемый способ как метод посевов, выявляет приблизительно равные запасы микробной биомассы в двухпочвах, но дает не условные, а абсолютные значения микробной биомассы,Кроме того, он позволяет найти причину более высокой ферментативнойактивности в черноземе: в этом почвенном образце численное значениец выше, чем в дерново-подзолистойпочве, При этом выявляет только жизнеспособные и метаболически активныемикроорганизмы (покоящиеся микроорганизмы не успевают прорасти на вносимом в почву субстрате за несколько часов измерений), рост микроорганизмов протекает непосредственнов почве, т,е, в естественных услови".ях, что гарантирует точность и полноту учета,Формула изобретенияСпособ определения количества микроорганизмов в почве путем внесе7 1298246 8ния субстрата в анализируемый мате- рование осуществляют в течение 5- риал, инкубирования, измерения на - 96 ч, дополнительно измеряют скочальной :.корости потребления субст- рость потребления субстрата в прората и последующего расчета количест- цессе инкубирования, а метаболичесва микроорганизмов по отношению на кий коэффициент определяют по форчальной скорости потребления субст- мулерата к метаболическому коэффициен Й 1 п Чту, о т л и ч а ю щ и й с я тем, У ЙСчто, с целью повышения точности спо- где Ч - скорость потребления субстсоба, используют ассимилируемые фор О рата;мы.субстрата, субстрат вносят в ко- У - экономический коэффициент; личестве 0,5-2,5 мг/г почвы, инкуби- - время инкубации,Таблица 1 0 1 2 Время инкубации, ч Скорость образования СО,мкг. С/ч г 5,0 5,05 5,21 5,32 5,46 5,6 Та.блица 2 0 1 Время инкубации, ч Скорость образования СО,мкг С/ч г 6 фО 6 е 2 64 6 э 5 6 ф 8 7 эО Таблица 3 Время инкубации, ч 0 12 24 38 48 62 72 Остаточное содержание аммония,мкг И/г 125 122 112 100 80 50 0 Скорость потребление аммония,мкг Ю/ч.г 0,25 0,83 0,86 2,00 2,14 5,0 Таблица 41 11 Время инкубации,ч 0 24 48 72 96 Остаточное содержание нитратов,мкг М/г 340 318 284 246 200 Скорость потребления нитратов,мкг М/г ч 0,94 1,42 1,58 1,921298246 10 Таблица 5 Время инкубации, ч 0 64,85 69,10 67,00 0,84 0,86 Составитель В.РомановаРедактор Н,Рогулич Техред А.Кравчук Корректор И.Эрдейи Заказ 862/26 Тираж 500 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5Производственно-полиграфическое предприятие, г.ужгород, ул.Проектная, 4 Остаточное содержание нитратов,мкг И/г почвы Скорость потребления нитратов,мкг М/ч г почвы Г" Т"