Способ определения концентрации ионов щелочных, щелочно земельных металлов и аммония в биологических жидкостях

(5 И РЕДЕЛЕНИЯ КОННЫХ, ЩЕЛОЧНОАММОНИЯ В БИОЛОГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ ИСАНИЕ ИЗОБР(72) Фридрих Фегтле, Иоханнес Петер Дикс н Дитер Яворек (ФРГ) (71) Берингер Маннхайи, ГМБХ (ФРГ) (53) 61607 (088.8)(56) 1, Биохимические методы исследования в клинике. И., 1969, с. с. 419-426 (прототип),(54)(57) 1 ъ СПОСОБ ОПЦЕНТРАЦИИ ИОНОВ ЩЕЛОЧЗЕМЕЛЬНЫХ МЕТАЛЛОВ И. ГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЯХ путем;спектроскопического исследования пробы, о тл и ч а ю щ и й с я теи, что, с целью повышения чувствительности способа, осуществляют вэаимодействи исследуемой пробы с комплексным лигандом, выбранньи иэ группы; кронен эфиры, криптанды или потанды, а такае их производные, содераащие химические мостики илн цепи с олиго- или полиэтиленгликолевции группаии, циклическим пептидои, содераащим тетрагидрофуран, слоаноэфирно-связанный макролид, валиноэоцин или нонактин, а такне хроиофор, выбранный иэ группы веществ, обладающих полненовой, хиноновой, аэо-иидофенольной, стильбеновой нли цианиновой структурой, игщ нх литиевых, натриевых, калиевых, аимониевых, кальциевьх или магниевых солей, причем хроиофор и лиганд берут в соотношении 1:1 на 100 или более частей исследуемой пробы е2. Способ по н.1, о т л и ч а ющ и й с я тем, что осуществляют= вэаимодействие исследуемой пробы с комплексным лигандои, нанесенным на впитывающий носитель.Изобретение относится к клинической биохимии, в частности, к способу определения концентрации ионовщелочных, щелочноземельных металлови аммония в биологических жидкостях.Известен способ определения концентрации ионов щелочных, щелочноземельных металлов и аммония в биологических жидкостях путем спектроскопического исследования пробы 13. 10Однако известный способ отличаетсядлительностью осуществления, трудоемкостью, низкой чувствительностью, атакже требует специальной аппаратуры.тЦелью изобретения является повышение чувствительности способа,Поставленная цель достигаетсятем, что согласно способу определенияконцентрации ионов щелочных, щелочноземельных металлов и аммония в биологических жидкостях путем спектроскопического исследования пробыосуществляют взаимодействие исследуемой пробы с комплексным лигандом,выбранным из группы: кронен-эфиры, 25криптанды или потанды, а также ихпроизводные, содержащие химическиемостики или цепи с олиго- или полиэтнленгликолевыми группами, цикли,ческим пептидом, содержащим тетрагидрофуран, сложноэфирно-связанный макролид, валиномицин или нонактин,а также хромофор, выбранный из груп"пы веществ,обладащих полиеновой, хи"ионовой азо-индофенольной, стильоеновой или цианиновой структурой,или их литиевых, иатриевых, калиевых,аммониевъи, кальциевых или магниевыхсолей, причем хромофор и лиганд берутв соотношении 1:1 на 100 или более40частей исследуемой. пробы.Кроме того, осуществляют взаимодействие исследуемой пробы с комплексным лигандом, нанесенным навпитывающий носитель. 45Способ осуществляют следующим образом.В качестве селективных комплексных лигандов берут циклически илиациклические высокомолекулярные соединения со средним молекулярнымвесом, которые по отношению к определяемому иону выступают как комплексообразователи или как мопекулахОзяин и В нх присутствии прини 55мают необходимую для комплексообразования или образования аддукта.структуру взаимодействия "гость" -"хозяин". Так, н качестве комплексных лигандов или молекул-"хозяев"пригодны соединения типа простыхолигоэфиров, простых полиэфиров,сложных олигоэфиров, сложных полиэфиров, олигоамидов и полиамидов.Хорошо пригодны, например, простыекронен-эфиры, криптанды, потандыили их производные, а также циклические пептиды или пептиды, которыев присутствии определяемого ионаили полярного вещества принимают необходимую для комплексообразованиявторичную, третичную или четвертичную структуру. Кроме того, используют содержащие тетрагидрофуран,сложноэфирно-соединенные макролидыи аналогичные соединения, которые могут регулировать в биологическихсистемах транспорт ионов, а такжечистые углеводородные каркасы какмолекулы-"хозяева (липофильные пустоты), циклодекстрины, циклофаны,Возможны также комбинации указанныхсоединений,Производные комплексных лигандовили молекул-"хозяев" могут иметьмостики или цепи, которые могут содержать олиго- или полиэтиленгликолевые группировки или другие содержащие гетероатом группировки.Ковалентно, гетерополярно или гидрофобно связанный хромофор представляет собой краситель, флуоресцентный краситель или хромоген, абсорбционный спектр которого изменяется за счет такого взаимодействия, как смещение заряда и нарушение мезомерии в основном либо в возбужденном состоянии благодаря "гостевым" частицам (полярным ионам или липофильным "гость"-молекулам). В качестве красителей используют например, тактовые полиенового, мерихиноидного, хинонового, азо- (как метилорань или метилрот), пирролового, мероцианинового, индиго-, индофенолового, стильбенового, азометинового, антрахинонового, нафтохинонового, цианинового, фталеинового, полиметинового, ализаринового типа.Содержащийся в комплексе-включении или в молекуле-"хозяине" хромофор может быть кислым красителем или его солью, например литиевой, натриевой, калиевой, аммониевой, кальциевой, алкиламмониевой или магниевой. Оо 4.Р О лько оз ига ер карка ут .ахоодинаковыхсителей).новываться, анизме М И - 11 Е) множество м крупных и с и трициклич солью. Краситель при этом содержитгредпочтительно карбоксилатную,сульфонатную,фенолятную или тиофенолятную группировку, Определяемыеионы могут быть катионами и анионами, прежде всего ионами щелочных металлов (лития, натрия, калия), аммония щелочноэемельных металлов (магния и кальция) или другими металлическими ионами, например ионами Отяжелых металлов (железа, цинка,меди, кобальта, никеля, молибденаи хрома). Прежде всего определяютсяорганические катионы, например ионыолигоалкиламмония, Фосфония, гуанидина, хинолина. В качестве определяемых анионов нужно назвать хлорид-,бромид-, иодид-, сульфат-, нитрит-,нитрат-, фосфат-, дифосфат-, триФосфат-, гидрофосфат-, гидрокарбонат-ионы, В качестве нейтральных полярных веществ используют нейтральные "гость"-частицы, например мочевину, тиомочевину, гуанин, гуанидин, мочевую кислоту, холин, креатинин, амино-кислоту, сахар; в качестве типичных липофильных "гостевых" молекул - стероиды (холестерин)и липиды (триглицериды, лецитины).Концентрацию катионов и анионов, ща также концентрации нейтральных"гостевых" частиц можно определятькачественно и количественно предлагаемым способом благодаря эффектам.расцветки (фотометрически).35о оГ6=111 ОО,О о. Эпричем Ме+ может означать, например,ион щелочного, шелочноземельногометалла, аммония или ион тяжелогометалла, причем в основе лежит систепричем в означает числа 0-4,Химия простых кронен-эфиров,криптандов и потандов охватываеСелективность может относиться . как к отдельному, определенному иону или определяемому веществу, так и к группам ионов или к группе веществ, Для этого применимы, например, такие хромофоры, как красители с несколькими одинаковыми или разными комплексными лигандами или молекулами- "хозяевами",например простыми кронен. эфирами с различными размерами пустот, как в формуле причем 1 в и и предпочтиначают числа 0-4.Далее, на комплексноммолекуле-"хозяине", напримпростого кронен-эфира, модиться один или несколькоили разных:хромофоров (крИзменение окраски может онапример, на следующем месогласно формуле ( и ): согласно формуле (В ),ние энергии которой .возбужденном состоянии,различны:(61 одов связывания более дних колец, а также биких систем с (СН) в , 1135436арил- и гетероатом-содержащимис труктурными элементами,Простые кронен-эфиры (корончатыеэфиры), криптанды и потанды-молекулы обладают способностью образования стехиометрических кристаллических комплексов, а также селективнымили специфическим комплексованием,например, ионов щелочных, щелочноземельных металлов, аммония и тяжелых металлов, а также нейтральныхмолекул.Получен ряд аэо-, ди- и трифенилметановых красителей из структурногоэлемента согласно Формуле ОУ ) г 5(Р,-водород, и = 1-3) и формуле (/ч).На этих аэокрасителях можно, в зависимости от размера кольца, наблюдать.селективный, специфический для каждого иона сдвиг видимого максимума 20абсорбции в определенном направлении, который часто связан с изменением молярной экстинкции. Большинство спектральных изменений ( ,д )вызывает, как правило, оптимальйо г 25пригодный для определенного кольцапростого кронеи-эфира из соответствующей группы периодической системыотносительно радиуса катион, 30й )о/ он о 4 Изобретение охватывает также использование комплексных лигандов в Форме цикличеекого пептида или пептида, который в присутствии иона или полярного вещества принимает необходимую вторичную, третичную или . четвертичную структуру, Так, могут применяться ионоформы природных веществ (валиномицин, нонактин, грамацидин и подобные пептиды) для предлагаемых согласно изобретению ионоселективных цветных реакций или цветного теста. В валиномицин включается соль красителя, например 2,4-динитрофенилгидроазонийхлорид, пикрат натрия или подобный краситель, Комплекс валиноцимин-краситеь имеет другой цвет или другой максимум абсорбции по сравнению с свободным красителем, Во второй стадии к комплексу валиномицин-краситель добавляют солевой раствор, в котором определяют концентрацию, причем специфический для калия налиномицин ксмплексуют имеющиеся в растворе ионы калия, благодаря чему краситель вытесняется иэ пустоты валиномицина и раствор снова приобретает другую окраску или другой спектр абсорбции,Таким образом, для теста окраски можно использовать специфичность к калию валиномицина. В качестве простой системы красителя, которая пригодна для внедрения или присоединения к валиномицину и последующего вытеснения ионами калия, можно использовать соли гидразиния с различными связанными мезомерными . системами, например с аэо-функциями. Применяют стерически малотребовательные катионы красителей, которые образуют с валиномицином слабо, однако достаточно стабильный комплекс, который затем можно количественно разрушать с помощью ионов калия, также в незначительной концентрации.Аналогичные, опыты с кронен-эфирами, например с кронен-эфиром (18)- -крон-б, которые имеют срачнимую структуру, (валиномицин и нонактин) позволяют установить отчетливые эффекты расцветки или изменения более длинноволновой абсорбции красителя в связанном с кронен-эфиром н в свободном состоянии. Применение как катнонных солей красителей (ионов 2,4-динитрофенилгидразония), так и ачионных хромофоров (пикрат-ионов) дает возможность выбора в соответствии с используемыми компонентами.П р и и е р 1. Фотометрическое определение калия с помощью ионоселективного красителя, который содержит хромофор, ковалентно связанный через мезомерную систему.Ионоселективный краситель формулы 1,И ), где и= 1, растворяется в хлороформе и встряхивается с раствором, содержащим ионы калия. Закомплексованный с калием краситель переходит в водную фазу и может количественно определяться при 60 нм нафотометре в зависимости от активности имеющихся ионов калия.Краситель 15-нитро,3-тиазол-азо-(3-) 12-окси,4,7, 10-тетраоксадодецил/4-оксибензол 3 получают путемвведения во взаимодействие 2-амино-нитротиазола в 853-ной фосфорнойкислоте с нитритом натрия и последующей добавки бензо-(15)-крона,Суспензию интенсивно красного цветасмешивают с водой и экстрагируютхлороформом, После высушивания надсульфатом натрия и удаления растворителя в вакууме разделяют на силикагеле с помощью колоночной хроматографии. С помощью хлороформа получают сначала краситель с замкнутымциклом 5-нитро,3-тиазол-азо-/ 1,4, 7, 10, 13-пентаокса/13/3,4/-бензофан/). Путем добавки 57 этанолак элюенту получают открытоцепной краситель Формулы (.й ), где о = 1.П р и м е р 2. Для исследованиясвойств указанного в примере 1 ионоселективного красителя ленточнымтестом раствор красителя наносятпутем накапывания на полоски фильтровапьной бумаги и эти полосы высушивают. Обработанные таким образом 30полосы бумаги окрашиваются в темнокрасный цвет при добавке испытуемыхрастворов, которые содержат ионы калия. Наряду с этим качественным методом окрашенные полосы можно оценитьколичественно в отражательном фотометре,П р и м е р 3Селективное фотометрическое определение калия с помощью лиганда, который содержит ковалентносвязанный хромофор (соединение формулы (1 Ч ), где и = 1 и К 1= 0,2)В течение 3 ч подвергают взаимодействию 2,4-динитротолуол с М -(и-формилфенил)-аза(15)кроном, с 45несколькими каплями пиперидина прио100 С. Застывший расплав растворяютв небольшом количестве уксусногоэфира, фильтруют и концентрируют ввакууме. Очищают с помощью колоночной хроматографии на силикагеле спомощью смеси уксусный эфир - 5-103этанола. При концентрировании элюента выкристаллизовывается 2,4-динитро-(4,7, 10,13-тетраокса-азо-циклопентадец-ил)стильбен,7,5 мп красителя растворяют в250 мл метанола. Кроме того, готовят 0,1 М растворы хлористого кальция, хлористого натрия, хлористого калия, хлористого лития и хлористого магния в О, 1 М буфере триэтаноламингидрохлорид/МаОН с рН 7,0Кроме того, готовят ряд растворов с 0,001- О, 1 М концентрацией хлористого калия, в 0,1 М буфере триэтаноламингидрохлорид/Р 1 аОН с рН 7,0. 3 мл раствора красителя смешивают с 0,5 мп соответствующего исследуемого раствора соли и при 366 нм определяют абсорбционные свойства и фотометре. Этот краситель показывает по отношению к калию другой спектр, чем в присутствии лития, натрия, кальция, бария и магния. Концентрация ионов . калия прямо пропорциональна экстинк ции.П р и м е р 4. Фотометрическое определение кальция и лития с помощью гетероциклического простого кронен-эфира формулы (1", ).1,4-Бензохинон-(4,7,10,13-тетра" окса-азоцикло-пентадец-ил)- фенилимин получают путем окислитель- ного сочетания г 1-(4-амина-фенил)аза- (15)кронас фенолом. Затем вводят во взаимодействие нитрат серебра с хлористым натрием и небольшим количеством крахмала, добавляют карбонат натрия и Фенол и прикапывают раствор М -(4-амннофенил)-аза( 15)-кронав концентрированной соляной кислоте. После взаимодействия перемешивают с уксусным эфиром, высушивают над сульфатом натрия и выпаривают в вакууме. Остаток кристаллизуют из тетрагидрофурана с эфиром.Л : 538 нм, 0 о. Е = 4,77, Краситель растворяют в хлороформе (Е 5 твим= 0,8) н смешивают с одинаковыми объемными частями водного солевого раствора. С литием и кальцием измеряют при 578 нм изменение окраски, концентрация которой прямо пропорциональна определяемым ионам,Фотометрию проводят при= 577 нм,йо Е = 4,41.Использование хромофорных криптандовых систем обеспечивает в водных средах наряду с более высокой устойчивостью комплексов лучшую селек тивность. Наряду с качественным и количественным Фотометрическим доказательством ионов щелочных и щелочноземельных металлов, а также ионов1135436 о" логические ткани от здоровых. Составитель Н.Хрусталева Редактор М.Циткина Техред О.Неце Корректор Л.ПилипенкоЗаказ 10114/46 Тираж 898 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 1 13035, Москва, Ж, Раушская наб., д, 4/5Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4 9аммония с помощью хромофоров-"хозя-ев" с различной величиной пустоты в растворах, например в крови или сыворотке и других жидкостях организма, их можно идентифицировать также на материалах носителя. При этом возможно применение в качестве распыляемого реактива для ионной хр матографии или силиконовых отпечатков, используемых в медицинской диагио стике. По образцу термогр афииможно делать видимыми эа счет изменений цвета Физиологические и патологические концентрации солей путемопрыскивания тканевых областейлибо их отпечатков с помощью ионоселективных красителей или Флуоресцирующих веществ. Благодаря этомусоздается воэможность отличать пато