Способ моделирования быстро развивающихся пролонгируемых состояний гипобиоза у теплокровных животных

(73) Тимофеев Николай Николаевич(54) СПОСОБ ИОДЕЛИРОВАНИЯ БЫСТРОРАЗВИВАЮЩИХСЯ ПРОЛОНГИРУЕМЫХ СОСТОЯНИЙ ГИПОБИОЗА У ТЕПЛОКРОВНЬЗХЖИВОТНЫХ(57) Изобретение относится к экспериментальноймедицине, Способ заключается в том, что животным (крысам, кроликам) вводят орнид в дозах. 10 -25 мг/кг для крыс и 15 - 30 мг/кг для кроликов, азатем вводят подкисленный, например, аскорбиновой кислотой серотонин 5 - 10 мг/кг, При этомвыведение животного на режим пролонгирования исходной. 4 э.п. -пь Комитет Российской Федерации по патентам и товарным знакам осуществляется либо форсированным охлаждением до уровня развития "холодового наркоза", либо при температурах среды режима пролонгирования, а выведение из гипобиоза осуществляют кратковременным повышением температуры среды до +, После чего окончательная нормализация жизнедеятельности животных проходит при комнатной температуре. "Сверхбыстрое" получение нормотермицеского гипометаболизма осуществляют введением 10 - 15% от всего количества орнида медленно или капельно внутривенно, а после этого - основной дозы - внутрибрюшинно или внутримышечно. Длительность пролонгированного состояния поверхностного гипобиоза выше уровня "холодового наркоза" регулируют повторными премедикациями через каждые 7 - 12 ч, причем доза повторно вводимого орнида ограничена в пределах 50% отИзобретение относится к экспериментальной биологии и медицине, а именно к экспериментальной физиологии, и преднаэ" начено для быстрого получения состояний искусственного гипобиоза у теплокровных животных, близких по физиологическому механизму развития к состоянию естественного гипабиоза, генетически обусловленного "факторами спячки" у гетеротермов.Известны способы получения искусственного гипабиоза путем инактивации адренергических влияния с использованием веществ, вызывающих опустошение катехоламинавых резервов организма, например, рауседилом в дозах 0,4 - 0,8 мг/кг массы с последующей компенсацией серотанинергического дефицита путем введения предшественника сератонина 5-окситриптофана (5-НТР) в дозах 75 - 125 мг/кг массы животного,Недостатком этого способа является слишком медленное развитие состояний гипобиоза и недостаточна глубокий уровень гипометаболизма, что обаясняется медленным развитием процессов инактивации адренергических влияний в организме и требует времени 15 - 20 ч,Целью изобретения является сокращение времени введения в гипабиоз при одновременном сохранении физиологичности состояний пересройки нейрохимическай регуляции в приближении к механизмам развития естественной спячки и выхода из нее гетератермов. Способ позволяет достичь быстрого и сверхбыстрого развития гипобиотическаго состояния при одновременном обеспечении воэможности поддержания уровней гипабиоза разной глубины и длительности,Цель достигается применением веществ, блокирующих высвобождение адренергического нейраметиатора, чта соответственно ведет к очень быстрой инактивации адренергиесих влияний в организме и развитию пайкилотермии, Полученное этим способом состояние искусственного гипабиоза у крыс и кролика путем однократного введения веществ возможна поддерживать в течение 7-12 ч поверхностный и средний глубины гипабиаз) и длительно 3 - 5 сут и более глубокий гипобиоз) с последующим выведением из этого состояния только за счет повышения температуры окружающей среды (Тр), Во всех случаях восстановление жизнедеятельности происходит очень быстро с эффективной и полноценной нормализацией физиологических функций (иногда с умеренной гиперфункцией), что также принципиально отличает этот способ от известных,Способ осуществляется следующим образом. Животным (крысам, кроликам) вводят орнид в дозах 10-25 мг/кг массы длякрыс и 15-30 мг/кг для кроликов внутрибра 5 винно или внутримышечно, Симпатолагический эффект орнида связан с блокадойвысвобождения адренергического нейромедиатора из окончаний -имсимпатическихнервов и возникновением адренергическа"0 го дефицита (40-500/О) в организме. Послеснижения адренергических влияний вводится подкисленный серотонин в малых дозах(1 0-5 мг/кг), что в течение 20-30 мин ведетк развитию поверхностного нормотерми 15 ческаго) гипобиоза.со снижением уровняметаболизма на 30-35.Возможен ускоренный вариант "сверхбыстрого" получения нормотермическогогипобиаза с аналогичными характеристика 20 ми, для чего часть дозы вводимого орнида впределах 10 - 15% ат основной) вводитсявнутривенно, а все остальные условия эксперимента сохраняются, Внутривенное введение арнида необходимо проводить оченьмедленна, а лучше капельно 10-кратноразведенным в физиологическом растворе.Такое введение позволяет вызвать пойкилотермию очень быстро, через 3 - 5 мин от начала эксперимента, так как блокада30 адренергического нейромедиатора наступаетпрактически мгновенно по мере поступленияорнида в сосудистое русло, вплоть да началадействия его основной дозы, которую обычна вводят одновременна с серотонином35 внутрибрюшинно или внутримышечно.Достигаемый при этом гипаметаболический эффект через 15-20 мин) в условияхнармотермии сохраняется 7 - 8 ч, возрастаетпа мере снижения температуры тела, в тем 40 пературных диапазонах средней глубинысохраняется до 12 ч и более. Весь периоддействия введенных препаратов состояниегипобиоза может поддерживаться на любомзаданном температурном уровне с саатвет 45 ствующим снижением метаболизма на 30 -40 и более,Поверхностные состояния гипобиазавозможно поддерживать и более длительно,но для этого через каждые 7 - 12 ч праланги 50 рования, когда эффективность действияпредыдущей премедикации ослабляется очем можно судить по активации процессовнесакратительнаго термогенеза и появлению тенденции и самасагреванию), необхо 55 дима повторная премедикация дозой,составляющей не более 50 от исходной.Чем более низкой уровень Тт выбрандля пролонгирования, тем более продолжительно сохраняется термоблакирующий эффект применяемых веществ, В глубокомтемпературном диапазоне, когда наступает "холодовой наркоз", самосогревание не возникает даже лри длительном пролонгировании гипобиоза, и повторных введений орнида не требуется даже при 3 - 5-суточном поддержании гипобиоза. В этой связи было важно оценить сохранность изначальной перестройки знергообмена в период пролонгированного гипобиоза, который принципиально отличается от всех известных видов гипотермии, включая так называемую клиническую "гибернацию", имеющих двухфазное проявление: первоначальную хоподовую стресс-реакцию с выраженной гилергликемией. в последующем сменяющейся гипокликемией, ведущей в конечном счете к гибели животных при длительном лролонгировании, В гилобиазе уровень гпикемии поддерживается обычно в пределах 50/ отнормы и очень медленно достигается или превышает исходную норму, Результаты проведенных исследований подтвердили устойчивую сохранность энергообеспечения организма с переключением на липидный обмен весь период длительного пролонгируемого гипобиоза.Оптимальные соотношения доз вводимых препаратов, последовательность и временные режимные характеристики получены экспериментальным путем,Нижний предел дозы вводимого орнида определяется минимальным уровнем инактивации адренергических влияний и легко контролируется по стейени включения термогенных реакций (несократительного термогенеза и, тем более, дрожи), по уровню содержания катехоламинов в крови, по уровню артериального давления крови, поведенческим реакциям и др. Верхний предел дозы орнида ограничен опасностью нарушения сердечной деятельности.При уменьшениидозы серотонина ниже 5 мг/кг массы не удается в достаточной мере блокировать сукцинатный цикл тканевого дыхания и соответственно в полной мере блокировать термогенные реакции, а превышение дозы 10 мг/кг массы приводит к чрезмерному подавлению этих процессов, что создает трудности,по управлению состоянием гилобиоза, Экспериментально установлена возможность пролонгирования действия серотонина и предохранения его от разрушения путем подкисления. Введение малых (3-5 мг на инъекции) доз аскорбиновой кислоты оптимизирует этот процесс.Ниже л ри в еде н ы некоторые характерные примеры осуществления предложенного способа моделирования гипобиоза у теплокровных животных, проведенные накрысах и кроликах,П ример 1, В опыт было взято 5 белыхбеспородных крыс-самцов, массой 25:+5 г,5 при температуре теда (Тт) 36,5 =0,4 оС. Потребление кислорода (ПК) в норме, принятой за 100%, в мл/кг мин составило: укрысы 1 - 52,8; у 2 - 52,0; у 3 - 53, О; у 5 - 52, О.В 8,00 животным внутриброшинно вве 10 ден орнид из расчета крысам 1, 2, 3 - по 25мг/кг массы, крысам 4, 5 - ло 10 мг/кг массы, Через 30 мин после введения орнидаживотным внутрибрюшинно введен серотонин 8;дозах: крысам 1, 2, 3 - по 5 мг/кг15 массы, крысам 4, 5 - ло 10 мг/кг массы. Былаотмечена тенденция к незначительномуснижению Тт крыс(на 1-1,5 С). при этом Г Кснизилось у крысы 1 - на 30,5%, у 2- на 31%,у 3 - на 34%, у 4 - на 31,5%. у 5 - на 25,3%,20 Затем животных иммобилизироввли на досках с помощью металличес:их дужек, фиксирующих из в области шеи и спины, ипоместили в камеру с температурой средь(Тср 5 + 0,5 С, Через 1 ч Т крыс составила:у 1 248 фу 2251 офу 3 2460,42740у 5 - 28,1 С, ПК лри этом снизилось у крысы1 - на 60,2%, у 2 - на 58,5 "/о, у 3 - на 60%; у4 - на 48,3%; у 5 - на 474. После этого крысперевели в камеру с Тсо 17 - ." 1 оС, где их Тт30 стабилизировалась на уровнях: у крысы 126 оС, 2 26 1 о 3 26 Оо, 4 .;.1 8 о.у 5 - 32,0 С, Состояние гипобиозп при Тс17 + 1 оС поддерживали в течение 2 суту крысы 1 при Тт - 26.1 -0,5 оС.; у 2 -26,0 +0,3"С; у 3 - 26,0 й 0.5 оС.(рьсы 4 и 5находились в состоянии гипабиоза в течение 5 сут при Тт 31,8 й 0,2 и 32,0 + 0,5 Ссоответственно. После окончания лрологирования животных поместили в лаоораторнУю кпеткУ с Тсо 24 0 + 0,5 оС, где чеРез 3 - Пч животные восстановили Тт до нормь,.П р и м е р 2, В опыт взято 13 беп дхбеспородных крыс-са.емцов, массой, 11 .: 7 г.при Тт 37,0 й 0,2 С, Всем животным введен45 орнид в дозе 15 мг/кг и сеоотонин в оо е 10мг/кг массы. Получение гипобиоза проводили по принятой схеме(см, пример 1). Черезсутки поддержания гилобиотического состояния при Т-,21 - 25 оС 5 крыс были декали 50 тированы. Остальные крысы оставлены дпя. нормализации физиологических показателей в лабораторной клетке лри комнатнойТср (23 - 24"С). Однако из оставленных крысдекалитирована спустя сутки после оконца"ния эксперимента, имея норл альную Тт, Оставшиеся 7 крыс декапитированы спустя 11сут после эксперимента, Отобранные пробыкрови и тканей всех животных. взятых в эксперимент, были использованы для олрее 2003185ления биохимических показателей углево- мл/кг минсоставило у кролика 1 - 20,0 дородного и липидного обмена, и у 2 21,5.Показано, что к концу первых суток про- В 8,00 кроликам внутрибрюшинно ввелонгирования гипобиоза гликоген печени в ден орнид из расчета 1 - 30 мг/кг массы, 2 норме равный 294,5 +11,42 мкмоль/г влаж -20 мг/кг массы, а затем серотонин из расной ткани) практически оказался исчерпан- чета 1-5 мг/кг, 2-10 мг/кг массы. При этом ным. Однако содержание сахара с Тткроликовснизиласьна 1-2 С,аПКснизисыворотке крови (при норме 5,392 + 0,02 лось у кролика 1 - на 30,4%, у 2 - на 25,8 ф 5. ммоль/л) поддерживалось на достаточно После этого кроликов иммобилизировали с высоком уровне, вероятно, за счет процес помоцью марлевых повязок на специальсов глюконеогенеза, не опускаясь ниже 1/3 ном столике в обычной позе спиной вверх и отнормы. Приэтомконцентрация неэстери- поместили в камеру при Тср 5 й 0,5 С. Чефицированных жирных кислот(КЭЖК) всы- рез 30-40 мин Тт кролика 1 снизилась до воротке крови была очень высока(в 3-4 и 25,1 С,ау 2-до 28 С. Уровеньметаболизма . более раз выше исходного уровня, равного 15 при этом снизился у кролика 1 на 68.8, а у 208 .т 11 мкмоль/л). Причем в зависимости 2-на 71,56% от исходного. Затем животных от индивидуалькьа особенностей живо- перевели на режим пролонгирования при тных, переключение организма на утилиза-. Тр 17 + 1 С, Спустя 30-40 мин Тт животных цию жирных кислот было выражено в стабилиэйроваласьнауровне;укролика 1 - разной степени: у трех крыс с более высо 28,0 С, а у 2 - .32 С,ким уровнем содержания НЭЖК (925 +25 Пролонгирование гипобиотического сомкмоль/л) содержание глюкозы а крови бы- стояния проводили при Тср 17 й 1 С в течело меньшим (4,76 й 0,02 ммоль/л), У двух ние 5 сут у кролика 1 при Тт 28,0 + 0,56 и других крыс с высокой активностьЮ процес сут у,кролика 2 при Тт 32;0 .ф,0 С, После аоа глюконеогенеза уровень глюкозы под окончания пролонгирования животных подерживался в пределах нормы или даЖе местиливлабораторнуюклеткуприТсроколо слегкапревыаал ее, составляя в среднем . 25 С, Через 2-4 ч у животных активизирова,59 + 0,1 ммоль/л(122 от исходного) на лись произвольныедвижения, Хорошее восфоне более низкого содержания НЭЖК в становление жизнедеятельности к периоду крови 650 й 58 мкмоль/л), Таким образом, ЗО нормализации Тт характеризовалось высо- первые сутки поддержания гипобиоза ха- койактивностью.практическивсехвидоврерактеризовались отсутствием истощения акций.энергетических субстратов. П р и м е р 4, У кролика породы "ШинЧерез сутки восстановительного перио- вилла", самца, массой 3050 г при Тт 38,0 С да уодной из взятых на исследование крыс 35 ЙК в норме, принятой за 1000 , составило отмечали следующие изменения: глюкоза23,2 мл/кгмин, Кроликаиммобилиэировали крови составляла 137% от нормы, гвикоген на станке при Тср 20,5 С, В 10.00 кролику печени увеличился с долей процента до 25% введен орнид из расчета 30 мг/кг массы, иэ от исходного уровня, а НЭЖК сыворотки этой дозы; 85% - внутрибрюшинно в комбикрови, напротив,снижалисьдо исходной ве нации с серотонином в дозе 10 мг/кг масличины, сы), а,15% дозы орнида разведено вЧерез 11 сут после окончания экспери- физиологическом растворе в соотношении мента у семи крыс указанные биохимические 1:10 и медленно введено в вену уха кролика, показатели в основном нормализовались При введении орнида внутривенно верхний (причем у некоторых животных с явлением 45 предел дозы ограничивается 15% от общего суперкомпенсации): глюкоза крови у четы- его количества всвязис воэможнойопаснорех крысравняласьисходной,удвух-.слег- стью нарушения сердечной деятельности, ка превышала норму (на 10%), а у одной чтоустановленоэкспериментальнымпутем. крысы - на столько же снижена, Гликоген . Внутривенное введение орнида продолжапечени у четырех крыс был в норме,у одной 50 лось в течение 1 - 2 мин капельно, под конт - превышал исходный уровень на 25 о , а у ролем артериального давленйя (АД), двух был на 20 - 27 ониже его. НЭЖК крови уровень которого поддерживался не ниже были в норме у двух крыс, у трех животных 60 мм рт, ст. при более низком АД введение - находилисьвпределах 120%отисходного орнида необходимо замедлить). Уровень уровня, а у одной крысы - ниже его на 40%; 55 метаболизма после завершения внутривенП р и м е р 3, В опыт взято два кролика ного введения препарата снизился на породы "Шиншилла", самцы, массой 1 - 17%, затем кролика поместили в камеру с 2950 г., 2 - 2960 г с Тт 38,0 и 37,8 С соответ- Тср 5 + 1 С и охладили его до Тт 28.0 ОС. К ственно. ПК, принятое в норме за 100%, в этому моменту ПК снизилось на 65%, после2003105 10 чего кролика перевели на режим пролонгирования при Тср 17 -1 С.В течение 1-го часа Тт стабилизировалась на уровне 32,0 С, а ПКсоставило 40,3 от нормы, Состояние гипобиоза поддерживалось в течение 3 сут, после чего кролика поместили в лабораторную клетку при Тср около 25 С. Через 2-3 ч отмечали хорошее восстановление жизнедеятельности, которое характеризовалось высокой активностью практически всех физиологических функций. Повышение температуры среды соответственно приводит к повышению температуры тела, но при Тт выше. уровня температуры "холодового наркоза" (что характеризуется активацией термогенных реакций - несократительного термогенеза, дрожи) восстановление жизнедеятельности начинает протекать по закономерностям, аналогичн ым восстановлению жизнедеятельности у гетеротермов, В этот период обогрев прекращали и процесс самосогревания протекал очень быстро, при комнатной Тср Это является общей закономерностью, которая установлена во всех опытах по заявленному способу как на кроликах, так и на крысах,Таким образом, предлагаемый. способ моделирования гипобиоза позволяет управлять процессом, получая разные по глубине и длительности поддержания состояния гипобиоза в предельно короткое время. Формула изобретения 1, СПОСОБ МОДЕЛИРОВАНИЯ БЫСТРО РАЗВИВАЮЩИХСЯ ПРОЛОНГИРУЕМ - ЫХЫХ СОСТОЯНИЙ ГИПОБИОЗА У ТЕПЛОКРОВНЫХ ЖИВОТНЫХ, путем введения симпатолитика, блокады сукцинатного цикла тканевого дыхания и иммобилизации животного с последующим поддержанием температуры среды ниже температуры тела, отличающийся тем, что животным вводят орнид в дозах 10 - 30 мг/кг, затем подкисленный серотонин в дозах 10 - 5 мг/кг соответственно, причем ,выведение нэ режим пролонгирования осуществляется как при форсированном охлаждении до уровня развития холодового наркоза, тэк и при температурах среды режима пролонгирования, а выведение из гипобиоза осуществляют кратковременным повышением температуры среды до (20 .ф.0,5)С,Все известные модели получения состояний гипобиоэа по механизму развития адренергеческого дефицита не являются аналогами естественной спячки, так как в 5 природе они исключают возможность самостоятельного самосогреван,ч в условиях реального катехоламинового дерицита в организме, но могут эффективно использоваться в народном хозяйстве и медицине.10 Предлагаемый способ блокады высвобождения адренергического нейромедиэтора из адренергических нейронов имитирует механизм инактивации адренергических влиянмй в естественном гипобиозе, т. е. со здает условия "ложного" катехоламиновогодефицита (нейромедиатор в наличии, но не выделяется из депо клетки), при котором достигается пойкилотермия, а в комбинации с серотонином - вь 1 раженный гипомета бойизм, на на этапах восстановленияжизнедеятельности процесс нормализации физиологических функций происходит быстро, с прбявлением дрожи, через 2 - 3 ч, эа счет сохранившихся в депо катехолэминов.25 Высокая физиологичность метода, приближающаяся по своим показателям в физиологии зимоспящих, позволяет рассчитывать на перспективу широкого его применения как в практической медицине, так и в при кладных областях, связанных с защитой организма в экстремальных условиях, (56) Авторское свидетельство СССР М 1091213, кл, 6 09 В 23/28, 1982. 35 . 2, Способ по п.1, отличающийся тем,что орнид в пределах 10 - 154 от основного количества вводят до поступления основной дозы внутривенно, причемвведение проводят медленно или капель"0 но, а основную дозу орнида и серотонинвводят внутримышечно или внутрибрюшинно,3. Способ по п.1, отличающийся тем,45 что подкисление серотонина проводят аскорбиновой кислотой.4. Способ по п.1, отличающийся тем,что проводят повторные премедикации орнидом через 7-12 ч дозой, ограниченной в50 пределах 50 от исходной,5, Способ по п.1, отличающийся тем,что время выведения животных иэ гипобиоза ограничивают повышением температуры тела до уровня выхода иэ состоянияхолодового наркоза, определяемого по появлению термогенных реакций