Способ получения иммуномодулирующих пептидов

,СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК183 б 954 А А 61 К 35/28 ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНВЕДОМСТВО СССР(71) Владивостокский государственный медицинский институт(56) Авторское свидетельство СССРМ 1077089, кл. А 61 К 35/28, 1979.(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММУНОМОДУЛИРУЮЩИХ ПЕПТИДОВ(57) Способ получения пептидов иммуномодулирующего действия включает экстракцию биологически активного вещества изкостного мозга млекопитающих, отделениебалластных веществ, влияющих на иммунную систему, вызывая выработку антител квысоко молекулярным фракциям полипептида, Способ позволяет получать биологически активное вещество с низкой Изобретение относится к медицине, в частности к медицинской биотехнологии, и может быть использовано при производстве лекарственных препаратов, стимулирующих иммунную систему организма.Целью изобретения является получение целевого продукта с высокой модулируюцей активностью.Способ осуществляется следующим образом.Свежий костный субстрат морского животного очищают, измельчают обычным способом, делят на три порции и каждую заливают 3трихлоруксусной кислотой. Смесь перемешивают в экстракционной колбе на холоде при -4 С в течение суток. зкстракцию проводят трижды и объединяют вытяжки всех порций, проводят диализ,промолекулярной массой, что снимает межвидовую чужеродность, дает возможность применять его в лечении человека, Фракционирование комплекса белков, полученных из костного мозга млекопитающих, привело к повышению его активности за счет изолирования фракции 1 и фракции 2. Иммуномодулирующее его действие направлено на В- и Т- системы иммунитета. повышая количество иммунокомпетентных клеток, статистически значимо при их дефиците, т.е, при вторичных иммунодефицитах. Одновременно происходит активизация резерва клеток иммунной системы, создавая базу для размножения иммунокомпетентных клеток. Способ позволяет уменьшить обьем реагентов; что делает его технологичным и обеспечивает экологически чистое производство, одномоментно повышает выход конечного продукта. 2 ил., 4 табл. тив дистиллированной воды. Высаливание осуществляют предварительно подсушенным сульфатом аммония (5 г соли на 1 л вытяжки). Надосадочную жидкость декантируют и к полученному прозрачному раствору приливают. ацетон (чда), предварительно охлажденный до -5 С. Осаждение протеинового комплекса ведется в течение 24 часов в холодной камере, Полученный осадок фильтруют через бумажный фильтр и высушивайт на аоздухе, Протеиновый комплекс извлекают многократной экстракцией бидистиллятом, предварительно нагретым до +37 С при постоянном перемешивании. В результате получают слегка опалесцирующую бледно-желтую жидкость, которую лиофилизуют. Высушенный препарат представляет собой легкийпорошок кремового цвета. Дальнейшееобессоливание и концентрирование ведутна ультрафильтрационной мембранеАщсоп РМ. Фильтрат лиофилизуют, порошок растворяют в малом объеме ацетатаммонийного буфера с рН = 6 (0,556 г в 2 млбуфера), немного подкисляя 0,1 Н раствором СНЭСООН до полного растворения.Гетерогенность комплексного пептидадоказывают, подвергая его гельхроматографии, Для этого элюировэние фракций ведутна колонке с сефадексом 0-50, предварительно уравновешенном в буфере. Контрольфракционировэния осуществляют обычнымспособом при помощи автоматического коллектора и аппарата "Юсотб". Профиль гельфильтрации устанавливали измеряяоптическую активность фракций на СФ"ЛОМО", Профиль элюции имел три пика,вид которых изображен на фиг.1,Фракции вцделенц препаративно. Спомощью диск-электрофореза в полиакриламидном геле с кумэсси голубым в присутствии додецилсульфата установлено, чтомалярная масса фракций соответственноравна 10 КД, 8 КД, 5-6 КД,Точечная молярная масса активнойфракции была определена нэ колонке с Р в присутствии декастрана голубого при элюции сукцинатным буфером обычным спосо-.бом, Молярная масса равна 5100-5300 Д,Наиболее оптимальные условия получения протеинового комплекса были подобраны экспериментально.В частности, режим высаливания предполагает применение насыщенных растворов, С этой целью была подобранаконцентрация вцсаливающего раствора, которая составила 5 г/л сульфата аммония,Для достижения полноты экстракциипротеиновых комплексов были проведеныэксперименты при разных температурах,Результаты показаны на фиг,2,Как следует из результатовисследования, наибольшая полнота экстракции комплекса достигается при 37 Споэтому этозначение было отобрано в качестве окончательного,Для установления пептидной природыкомплекса был проведен аминокислотныйанализ,Химический анализ суммарного полипептида представлен в табл, 1, аминокислотный спектр - в табл,2.Аминокислотнцй спектр активной фракции пентапептидной природы охарактеризсеэн глутаминовой (4,45), аспарагиновой(3.59 Я, лизином (2,82%), пролином (1,43),аргинином (1,49), тяжелцх металлов и алюминия в активной фракции не обнаружено.Пептиды были лиофилизированы при -10 С,По сравнению с аналогами предлагаемое техническое решение обладает новиэ 5 ной и рядом преимуществ (табл,3).Более подробные сведения об иммуномодуляторах преДставлены в табл,4,Комплексный полипептид, как видно,оказывал существенное влияние как на Ттак и В-лимфоциты. Однако, если в целомколичество Т-лимфоцитов увеличивалосьнезначительно (на 4,8 ), то на выход Т-лимфоцитов разной степени зрелости это действие было более выраженным, Уровень аута-РОК возрастал в 2.5 раза, стабильных Е-РОК - почти в 2 раза. Количество активности Е-РОК клеток регуляторного ряда (ТРРОК, ТЧ-РОК) изменялось в меньшей степени - соответственно нэ 2,61, 7,36, 3,04 . Синхронно с этим изменялся индекс - ТР/ТЧ - с 0.99 до 1.19.Более выраженным оказалось воздействие на общее количество.В-лимфоцитов.Их количество возрастало на,9,21 ь, то есть почти вдвое, но численность зрелых М-РОК имела тенденцию к уменьшению.Таким образом, комплексный полипептид обнаружил более высокую иммуномод-30 улирующую активность в отношенииобщего количества В-лимфоцитов, стабильных и аутосубпопуляций Т-лимфоцитов. несколько меньшую - в отношении ТР-РОК схелперной функцией (рост в 2,5 раза), общего количества Т-лимфоцитов (в 1,5 раза), активных Е-РОК (в 1.5 раза), стабильныхЕ-РОК (в 2,2 раза), А-РОК (в 4 раза), общегоколичества В-лимфоцитов в 3,1 раза, принейтральном отношении к Тч-РОК С супрессорной функцией, благодаря чему соотношение Тр/Тч приближалось к норме.Та же направленность изменений вуровне Т- и В- лимфоцитов. их субпопуляций, но менее выраженная отмечена у фракции 1,Фракция-И практически иммунномодулирующий эффект не обеспечивала.Таким образом, иммуномодулирующеедействие на Т- и В- лимфоциты с учетомстепени их зрелости и активности регуляторного звена Т-лимфоцитов наиболее выражено (убывающей степени) в фракции,фракции, комплексного полипептида,Они найдут широкое применение впрактическом здравоохранении для лече 55 ния больных иммунодефицитами различнойглубины и направленности,Формула изобретенияСпособ получения иммуномодулирующих пептидов, включающий измельчениекостного мозга, экстракцию уксусной кисло18369546 питающих, экстракцию проводят трехпроцентным раствором трихлоруксусной кислоты, а после осаждения сульфатом аммония целевой продукт зкстрагируют бидистиллированной водой, нагретой до 37 ОС. а очистку проводят ультрафильтрацйей и гел ьхроматографией,Таблица 1 Результаты исследований общего химического состава полипептидов,Моносахариды,Общий белок,Белок,Проба Нуклеиновые кислоты Полипепти ы 2,35 32,12 1,22 Таблица 2 Результаты исследования аминокислотнрго Состава полипептидов. е Сравнительная характеристик получения пептидов и иммуномЬеюМ в Предлагаемый способ Аалог 2 алог 1еювЮ ризна йный ско наземное сы Ьрское сырье Исто изкая и крайне Низкаизкая кая кономицеск.цгода уксуснаяНизкая р-р трихлорук-, ная к-та ксусная к-та Экстраг Низкая той, отделение примесей последующим осаждением целевого продукта, его очисткой и лиофилизацией, о т л и ч.а ю щ и й с я тем. что, с целью повышения выхо- . да и специфической активности 5 продукта, в качестве сырья используют костный мозг морских млекоехнологицность Высшая с малымобъемом экстраг Табл.ица предлагаемого спос дуляторов с аналог1836954 Продолжение табл.З Хлористый цинк Хлористый цинк Добавляемыеагенты СульФат аммония Высокая Высокая Отсутствует ТОКСИЧНОСТЬЗК ОЛОГ ИЧ НО СТ Ь Высокая за счетмалой токсичностиБидистйллят при+37 С., Обессоливанйе при рН=11,5 Низкая за счет Высокаявысокой токсичн,Ие указано Не указано Обеспечениеполноты извлечения Удаление малоактивных Фракций Не проводится Не проводится ГельФильтрация 5)00-5300 Д Отсутствует Не указано Не приводитсяНе указано Молекул. массыАллергичность Высокая и умеренная Днтигенность Не указано На В"звено Высокая, умереннаяНизкая Отсутствует Иммуномодулирую- Высокая на В- ищая активность Т-звено иммунитета Твблицв 4 19 ИУНОМОДУБРУЩАЯ АКББВЗСТЬ КОЙБИ(спОРО ПЩЙЕ 1 ТИПА К ЕГО 4 РАЕЕ 2 НА 1:аЕТОЮУЕ) ИБ 1 УНЮ 11 СИСТЕР КРО 1 Ы У ЕОНЬЯЗХ С ВЕОРКЧЯЪИ БЗПОДЙЙф 1 ТПЙТираж Подписноественного комитета по изобретениям и открытиям и 113035, Москва. Ж. Раушская наб., 4 Ю