Способ определения витамина а в биологическом материале

(72) А.С.Редчук, Е.Нцова, Е.С,Аушева М 4лиал Всесоюзн ого и проект итута биолог о науч но-конст- ической Киприянов В.Н,Бабий И.Кузне .Ф.Рын(ГОСПАТЕНТ СССР) ОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ Изобретение относится к аналитической химии, в частности к способам определения содержания витамина А в микрогранулированном препарате и премиксах,Определение витамина А возможно экстракционно-спектрофотометрическим методом по его собственному светопоглощению в Уф-области спектра, Известен и широко распространен фотометрический метод анализа витамина А, основанный на образовании окрашенных комплексных соединений, Соединения группы витамина А способны к образованию окрашенных продуктов реакции при взаимодействии с хлоридом сурьмы в хлороформе. Особенностью этой реакции является то, что относительная скорость распада окрашенного карбониевого иона очень высока и максимум интенсивности окрашивания наблюдается между 5-й и 10-й секундами от начала введения реагента, При замере оптической плотности позже 10-й секунды получаемые(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВИТАМИНА А В БИОЛОГИЧЕСКОМ МАТЕРИАЛЕ (57) Изобретение относится к аналитической химии. Цель изобретения - ускорение и упрощение анализа, а также повышение точности достигается тем, что экстракцию витамина А ведут при температуре 65 - 75 С в течение 6 - 10 мин двухкомпонентным экстрагентом при следующем соотношении ингредиентов, об.;ь: изопропиловый спирт 95,0-98,0; вода 5,0-2,0, а полученный экстракт анализируют на жидкостном хроматографе с использованием сорбента силасорб ЯРН Си и элюента следующего состава, об,; ацетонитрил - н-пропанол - вода 42:50:8. 3 ил., 4 табл. результаты занижены, т.е, резко снижается точность измерения. Неустойчивость окраски комплексного соединения - существенный недостаток данного метода, затрудняющий его практическое использование.Известны также хроматографические способы определения витамина А в различных биологических объектах.Наиболее близким по технической сущности к изобретению является способ определения содержания витамина А в молоке, заключающийся в извлечении витамина А из молока и хроматографическом анализе полученного экстракта.Извлечение витамина А осуществляется в н ес кол ь к о стадий.1. Омыление или щелочной гидролиз образца, содержащего витамин А, проводится 80%-ным водным раствором гидроокиси калия в течение 20 мин, при температуре 80 С, при этом разрушаются примеси, мешающиеколичественному определению витамина А(жиры, липиды и пр.).2. Витамин А переводят из водного раствора омыленной смеси в органическую фазу с помощью гексана, Для повышения 5чувствительности анализа гексановый экстракт витамина А упаривают досуха и сухойостаток растворяют в 0,1 мл метанола.Полученный таким образом концентратвитамина А, очищенный от мешающих примесей, подвергается хроматографическомуанализу, В качестве сорбента используютЧубас ТРС 18, состав элюента следующий,об.%: ацетонитрил-метанол 90:10. Время,необходимое для выполнения анализа составляет 2-2,5 ч,Однако известный способ имеет следующие недостатки;сложность и длительность процесса экстракции витамина А за счет многостадийности процесса и соответственно большиепотери витамина;разрушение и изомеризация витаминаА за счет его нестойкости в растворах иводных средах при нагревании в процессе 25омыления;использование в составе элюента дляхроматографирования метанола, являющегося сильным ядом,Целью изобретения является ускорение 30и упрощение анализа, а также повышениеточности определения витамина А,Это достигается тем, что в известномспособе определения витамина А в микровите А кормовом и премиксах, заключающемся в извлечении витамина и анализеполученного экстракта методом жидкостной хроматографии, экстракцию ведут притемпературе 65 - 75 С в течение б - 10 минводным раствором изопропилового спирта 40при следующем соотношении компонентов,об о/Изопропиловый спирт 95 - 98Вода 5 - 2,а полученный экстрактанализируют на жидкостном хроматографе с использованиемсорбента силасорб ЯРНС 1 а и элюента - смеси ацетонитрила и спирта, причем в качестве спирта использован водный растворн-пропанола при объемном соотношении: 50ацетонитрил - н-пропанол - вода 42:50:8,На фиг.1 приведена хроматограммараствора масляного препарата витамина А(ретинол-ацетат) в изопропиловом спирте;на фиг.2 и 3 - соответственно хроматограммы экстрактов витамина А из микровита А ип реми кса.Способ определения витамина А в микровите А и в премиксах осуществляется следующим образом. П р и м е р 1, Объект исследования -микровит А кормовой (далее микговит А),Навеску микровита А в количестве0,02 г, взятую с точностью 0,0005 г, помещают в коническую колбу объемом 25 см, кудазналивают 10 см экстрагента, содержащегозизопропиловый спирт - 97,0 об.% и воды3,0 об,о , Колбу соединяют с обратным холодильником и помещают в водяную баню стемпературой 75 С на 10 мин, Затем полученную смесь охлаждают до комнатнойтемпературы и фильтруют через фильтрШотта. Фильтрат собирают в мерную колбуобъемом 25 см . Коническую колбу и осадокзна фильтре тщательно промывают экстрагентом и раствор в колбе доводят дометки,Полученный раствор витамина А хроматографируют на жидкостном хроматографе "Милихром". Использована колонка2 ммх 80 мм, заполненная силасорбомЯРНС 18 В качестве элюента выбрана смесьацетонитрил - н-пропанол - вода == 42:50:8 (об.%), Измерения проводились сприменением УФ-детектора на длине волны328 нм, Объем пробы составлял б мкм, скорость подачи элюента через колонку -200 мкл/мин, Время, затрачиваемое на анализ, включая экстракцию, составляет 4045 мин. Хроматограмма экстракта измикровита А приведена на фиг,2,Содержание витамина А в анализируемом экстракте определяют по калибровочному графику, который строится вкоординатах "высота хроматографическогопика - содержание витамина А", Для построения калибровочного графика хроматографируют 5 - б растворов масляногораствора витамина А известных концентраций в изопропиловом спирте (фиг.1), Удерживаемый объем пика витамина Асоответствует 345 мкл, На хроматограммеэкстракта витамина А из микровита А (фиг.2)измеряют высоту пика, а затем по калибровочному графику определяют содержаниевитамина А в анализируемом экстракте.Для расчета содержания витамина А вмикровите А используется формулаХ= - уСд(1)где Х - содержание витамина А в анализируемом образце, МЕ/г;Сд - содержание витамина А в экстракте, определенное по калибровочному графику, МЕ;гп - навеска анализируемого образца, г,П р и м е р 2, Объект исследования -п ремикс, 1790895Навеску премикса в количестве 5 г, взятую с точностью 0,0005 г, помещают в коническую колбу объемом 25 см, кудаз наливают 15 см экстрагента, содержащегозизопропиловый спирт - 97,0 об.и воду - 3,0 об, , Колбу соединяют с обратным холодильником и помещают в водяную баню с температурой 75 С на 10 мин. Затем полученную смесь охлаждают до комнатной температуры и фильтруют через фильтр Шотта. Фильтрат собирают в мерную колбу объемом 25 см . Коническую колбу и осадок на фильтре промывают экстрагентом и раствор в колбе доводят до метки. Полученный экстракт хроматографируют на жидкостном хроматографе "Милихром" при следующих условиях, В качестве сорбента используют обращенную фазу силасорб ЯРН СБ. Элюент имеет состав, об. : ацетонитрил - н-пропиловый спирт - вода 42:50:8. Измерения проводились с использованием Уф-детектора на длине волны 328 нм. Обьем пробы составлял 6 мкл, скорость подачи элюента 200 мкл/мин. Время анализа, включая экстракцию, не превышает 40 - 45 мин, Хроматограмма экстракта из премикса П 5 - 1 приведена на фиг.З. Обработка полученных результатов и расчет содержания витамина А в премиксе выполняются так, как описано в примере 1,В табл,1 приведены данные, позволяющие оценить точность определения витамина А в премиксах, Для этого в лабораторных условиях готовились премиксы с точно известным содержанием витамина А, которое затем определялось так, как описано в примере 2,Из данных табл,1 следует, что относительное отклонение отдельного определения не превышает 7,8 . Причем, расхождения между параллельными определениями не превышает 4 - 5 отн.%. Согласно действующему в настоящее время ГОСТУ 26573,1-85, (Премиксы. Метод определения витамина А) эта величина может достигать 15 отн, ,С целью оптимизации условий экстракции витамина А из Микровита А и премиксов проводились специальные исследования состава экстрагента, времени и температуры экстракции,В табл.2 представлены результаты исследования влияния состава экстрагента на эффективность экстракции витамина А из Микровита А.Как видно из полученных результатов, при содержании воды в изопропиловом спирте менее 2,0 об.наблюдается неполная экстракция, и количество неэкстрагированного витамина А составляет 9,7-22,9 . 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Это связано с тем, что оболочка МикровитаА растворима в воде, но не растворима ворганических растворителях, При малыхконцентрациях воды в экстрагенте гранулыМикровита А разрушаются недостаточно, изначительная часть витамина А остаетсявнутри гранул, То есть в данном случае экстракция малоэффективна, Если концентрация воды в экстрагенте превышает 5,0 об. ,наблюдается существенное растворениеполимерной оболочки гранул, и примеси переходят в раствор вместе с витамином А,появляются признаки образования коллоидной системы в виде слабой мути и осадкапри хранении экстракта в течение нескольких часов, При этом наблюдается значитель-.ное снижение точности определениявитамина на 10 - 11,5.Начиная с концентрации воды в экстрагенте 9,0-10,0 об, , экстракт становитсяинтенсивно мутным и далее не анализируется,В табл.З и 4 приведены данные по влиянию температуры и времени экстракциивитамина А из Микровита А,Использование температур ниже 65 Спри условии, что состав экстрагента следующий, об.4: изопропиловый спирт - вода97:3, а время экстракции 10 мин, не позволяет полностью экстрагировать витамин А.Доля неэкстрагированного витамина значительна - от 6,9 и выше, При температуреэкстракции выше 75 С активность витаминаА резко снижается вследствие его разрушения, Так, при нагревании раствора втечение10 мин при температуре 80 С количествоопределяемого витамина А на 11,6 меньше его содержания в Микровите А, определенного по ТУ 64 - 05 - 130 - 76.Время экстракции 5 мин и ниже дажепри максимальной температуре экстракции - 75 С при условии, что состав экстрагента следующий, об. ,: изопропиловыйспирт - вода 97:3, не обеспечивает достаточно полного извлечения витамина А измикрогранул, Доля неэкстрагированноговитамина А составляет 11,7 . При увеличении времени экстракции до 15 мин и вышепроисходит разрушение витамина А, крометого, в экстракт переходят компоненты оболочки гранул, раствор становится коллоидным и далее не анализируется.Поскольку витамин А в премиксы вводится в виде Микровита А, условия экстракции и получаемые результаты в процессеопределения содержания витамина А в премиксах и Микровите А кормовом одинаковы,Использование предлагаемого способапо сравнению с прототипом позволяет зна1790895 Таблица 1 Таблица 2 Таблица 3 чительно упростить анализ, более чем вдвое уменьшить продолжительность анализа и повысить точность анализа в 2 раза за счет сокращения количества операций (с 3 до 1), что способствует уменьшению потерь исследуемого образца и параллельно с этим сокращению числа (от 7 до 4) и расхода (с 200 см до 25 см ) применяемых реактизвов. Формула изобретения Способ определения витамина А в биологическом материале путем экстракции витамина из исследуемого материала с последующим жидкостным хроматографированием на сорбенте с использованием элюента - смеси ацетонитрила и спирта, о тл ича ющийсятем,что, сцельюповыше ния точности, а также ускорения и упрощения способа, экстракцию проводят 95-987 о-ным водным раствором изопропилового спирта при температуре 65 - 75 С в течение 6-10 мин, а в качестве сорбента 10 используют силасорб ЗРНС 1 а, причемэлюент в качестве спирта содержит водный раствор н-пропанола при объемном соотношении ацетонитрил;н-пропанол:вода, равном 42:50;8,151790895 10 Таблица 4 н. Фиг иг.З Ред Коррект улла аказ 106 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ ССС 113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4(5 оизводственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул, Гагарина, 1 2 3ВремФиг 2 3 4 5 Время, ми Составитель А.Сед Техред М.Моргента 3 4 Время, мин.