Способ получения экзополисахарида

)5 С 12 ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИПРИ ГКНТ СССР ПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИ АВТОРСКОМУ ДЕТЕЛ ЬСТВ(71) Ладыжинское производственное биофармацевтическое объединение "Энзим" иВсесоюзный научно-исследовательский институт биотехнологии(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЭКЗОПОЛИСАХАРИДА(57) Изобретение относится к микробиологической промышленности и может быть Изобретение относится к микробиологической промышленности, биотехнологии и может найти применение при получении высокоочищенных препаратов экзополисахаридов (ЭПС), отличающихся способностью к образованию прозрачных высоковязких гелеобразных растворов для использования в парфюмерно-косметической промышленности, медицинских и пищевых целях, фармацевтике.Наиболее близким к изобретению является способ обработки ксантана для увеличения его вязкости и фильтруемости.Недостаткам этого способа является его неэффективность для культуральнай жидкости В.роупуха В, недостаточная прочность растворов и отсутствие гелеообразующих свойс 1 в,применено при получении высокоочищенных препаратов экзополисахаридов. Цель изобретения - увеличение прозрачности растворов экзополисахарида, а также увеличение их тиксотропности. Культуральную жидкость ВасИцз роугпуха ВКПМ Вподвергают сушке на распылительной сушилке при температуре сушильного агента на входе 105-115 С с последующим диспергированием полученного порошка в воде, нагреванием дисперсии до 80 - 100 С в течение 25-35 мин, последующим сепарированием смеси и выделением целевого продукта из жидкой фазы спиртом или путем ультрафильтрации, Для повышения тиксотропности после сепарирования раствор подщелачивают до рН 12,0 и выдерживают 25-35 мин при 80-100 С с последующей нейтрализациел раствора и выделением целевого продукта осаждением спиртом, 1 з.п, ф-лы, 3 табл. Целью изобретения является увеличение прозрачности растворов экзополисахарида, а также увеличение их тиксотрапносги.Сущность изобретения заключается в том, что используют культуральную жидкость В,роугпуха ВКПМ В, коагуляцию клеток в ней осуществляют путем распыли- тельной сушки при температуре сушильного агента на входе 105 - 115 С, полученный порошок диспергируют в воде, нагревают дисперсию до 80 - 100 С, выдерживают в течение 25 - 35 мин, сепарируют смесь и выделяют целевой продукт из жидкой фазы осаждением спиртом или ультрафильтрацией, С целью увеличения тиксотропности растворов ЭПС после сепарирования раствор подщелачивают да рН 12,0 и выдерживают 25 35 мин пр 1 80-100 С споследующей нейтрализацией раствора с выделением целевого продукта осаждением спиртом,Способ осуществляют следующим образом, 5Культуральную жидкость В.роугпуха, полученную при ферментации на гидролиз ванном крахмале и содержащую 20 г Э С/г, разбавляют водой в 2 раза и сушат н распылительной сушилке (температура 10 в здуха на входе 105 - 115 С, а на выходе - 5, -60 С). Полученный порошок дисг;ергируют в воде до концентрации 1-2; при пермешивании и нагревании до 45 С до илучения однородной дисперсии и исчез нвения комков, Затем полученный раствор вдерживают в течение 25-35 мин при 80- 100 С, образовав ш ийся осадок отдел я ют сфпарированием или центрифуги рованием (1=60 С). Из прозрачного фугата выделяю 20 ЭПС осаждением спиртами или получают 1%-ный концентрат с помощью ультрафильтрации. Для получения гелеобразующего полисахарида и увеличения тиксотроп ности его растворов прозрачный фугат, получен ный после сепарации и центрифугирования, выдерживают в течение 25 - 35 мин при рН 112 (10;ь ИаОН) и температуре 80 - 100" С.После охлаждения раствор нейтрализунт 6 н, Н 2504 кислотой и осаждают ЭПС 30 геремешиванием раст.-сра с изо-пропаногом или этанслом в соотношении 1:1,5 соответственно. Образовавшийся осадок громывают свежей порцией этансла л сушат в вакуумной или конвекционной сушил ке при 40 С,П р и м е р 1, Посевную культуру В,роугпуха (10 об,0/О) вносят в питательную Среду, содержащую, об. : гидролизованный кукурузный крахмал 3; БВКО,5; КН 2 Р 04 40 0,05;,К 2 НРО 4 фЗН 20 0,05, М 04 7 Н 20 0,04, СаС 2 0,02, Питательная среда должна иметь следующие показатели; рН 7,1 + 0,3; температура 28,2 + 2 г/л, концентрация РВобщ 28 + 2 г/л, концентрация РВ, не 45 менее 9 ч г/л, концентрация аминного азота 0,16 + 0,02 г/л, концентрация белка 3,0 + 0,5 г/л, отсутствие посторонних жиВых микроорганизмов.Процесс микробиологического синтеза 50 проводят в аппарате с рабочим объемом 100 дм при 28 + 10 С, рН 7,1+ О,З, давлении в аппарате 0,45 ". 0,5 кгс/см, аэрации 0,55 ч 0,05 м воздуха/мз средь в мин, скоз рости перемешивания 196 об/мин. Содер жание ЭПС в полученной культуральной жидкости 18 г/и. Г р и м е р ы 2-17. 10 дм культуральной3,жидкости В,Роугпуха полученной как списано в примере 1, разбавляют водол до 20 дм и сушат на распылительной сушилке при температуре сушильного агента на входе 100-125 С, Порошок (500 г) растворя эт при перемешивании в 25 дм воды, нагоевазют до 70-100 С и выдерживаю 1 грл этой температуре в течение 20-40 мин. Образовавшийся осадок отделяют сепарированием,Фугат смешивают с этанолом (или изопропанслом) в соотношении 1;1,5, образова в ш и йся осадок Э П С отдел я от, промывают этанолом и сушат в вакууме; для получения ЭПС в виде конценграта фугат ультраконцентрируют до содержания ЭПС 1%, Для получения гелеобразующего ЭПС фугат подщелачивают до рН 10-13 л выдеркивают при 70-100 С в течение 20-40 мин, После охлаждения до 25-30 С раствор нейтрализуют 6 н. Н 2804 кислотой, К раствору приливают изопропанол (в соотношении 1:1,5), промывают этанолом и сушат в вакуумной или конвекционной сушилке.Из полученных препаратов сухих зкзополисахаридов 170 - 189 г) готовят 1,-ный раствор и определяют параметры дисперсности: мутностью(см 1), вязкостьдин (Па с), тиксстропность, Эти же параметры определяют для 1%-ных концентратов ЭПС,Л р и м е р 18, 1 дм культуральнсй жидкости В,рсугпуха, полученной как списано в примере 1, разбавляют в 2 раза водой, на ревают до 1400 С и выдерживают пои данной температуре 30 мин. Получснньй осадок отделяют сепарированием или центрифугированием а тех же условиях, что и в примерах 2 - 17. Далее фугат обрабатывают аналогично примерам 2 - 17.П р и м е р 19. 1 дмз культуральной жидкости В.роущуха, полученной как описано в примере 1, разбавляют в 2 раза водой, нагревакт до 100 С и выдерживают при данной температуре и рН 5,5 в течение 15 мин, Далее центрифугируют и осаждакт супернатант изопропанолом в соотношении 1:2 соответственно, Осадок полисахарида отделяют на фильтре и сушат в вакууме40 оС,П р и м е р 20, Культуральную жидкость Вас.роугпуха обрабатывают аналогично описанным примерам. Порошок, полученный после распылительной сушки 500 г, растворяют,при перемешивании в 25 дм воды и выдерживают при 90 С в течение 30 мин. Образовавшийся осадок отделяют сепарированлем. Эугат концентрируют на ультрафильтрационной установке БТУдо концентрации ЭП 1 Д Этот концентрат анализируют на вязкость и мутнос 1 ь:,ч 1 н.вязкость 0,86 Па с, мутность т.= 0,381"., 1/сгл,При нагреве в течение 35 мин р= 0,876Па. с, г =- 0,365 1/сгл. Вязкость проверяют наротационноь 4 вискозиметре РЕОМАТ." 0 Я.Данные экспериментов представлены втабл.1,Как видно из табл.1 (примеры 2 - 7), использование сушильного агента с температурой на входе ниже 105 С приводит к 10образованию влажных комков в результатссклеивания частиц, что дает резкое увеличение мутности ( т) и, следовательно, уменьшение прозрачности растворов. При этомсущественно увеличивается время растворения препарата полисахарида и несколькоуменьшается вязкость раствора. Увеличение температуры сушильного агента выше115 С нецелесообразно, так как время растворения и мутность раствора препарата 20при этом не уменьшаются, а вязкость раствора не увеличивается, но возрастает расход энергии на нагрев сушильного агента.Сокращение времени нагрева растворадо 20 мин (примеры 8 - 12) приводит к недостаточной коагуляции клеток продуцента врастворе, что затрудняет их дальнейшее отделение, Растворы, образующиеся из конечного продукта, имеют небольшуювязкость и большое значение параметра 30(пример 8). Увеличение времени нагрева да40 мин также нецелесообразно, так как неприводит к улучшению показателей вязкости и прозрачности (примеры 1", 12).Уменьшение температуры нарева раствора ниже 70 С ухудшает эффективностькоагуляции клеток продуцента в растворе, аувеличение ее выше 85 С лишь незначительно улучшает показатели ти ц дин, раствора конечного продукта и не оправдывает 40энергозатраты, Все препараты обладалипрактически мгновенной тиксотропностью(не более 3 с).В табл.2 представлены значения параметров дисперсности (мутности тсм 1; числа дисг;ерсных частиц Й, см; массовой-з,концентрации дисперсных частиц С, г/см;радиуса дисперсных частиц г, мкм) растворов различной концентрации; пектина яблочного (фармахим); ксантана (Ягцгпэ); 50полисахарида В.роугпуха, полученного попредлагаемому способу. Наименьшее значение т имеют растворы В.роутуха при всех рассмотренных концентрациях, при этом значения г растворами В,роугпуха на порядок ниже, чем у ксантана и пектина. Мутность (т) растворов полисаха,ддо. В.раугпуха в отличие от ксантана и пектина увеличивается крайне медленно с ростом концентрации полимера в растворе, ;то указывает на хорошую растворимость первого в воде, Концентрация диспергироеан наго (нерастворившегося) вещества (С) у полисахаридов В.роугпуха на порядок ниже, чем у ксантана и пектина, Размер часп ц диспергированных полимерных агрегатов В раоугпуха в растворе меньше, а их число больше, чем у ксантана и пектина.Растворы ЭПС (по примеру 5), полученные после сепарчравания, выдерживают в течение 20 - 40 мин пои 70-100 С пои рН 10 - 13. Полученные результаты представлены в табл,З, Эффективность обработки контролируют по динамической вязкости 1%-ных растворов и их тиксотрапности.Таким образам, оптимальными паоаметрами щелочной обработки являются рН 12,0 температура 90 С, время выдержки ЗО мин,Формула изобретения 1. Способ палучечия зкзопалисахарида включающий каагуляцию клеток в культу- ральной жидкости и их отделение, а т л и ч аю гц и й с я тем, что, с целью увеличения прозрачности растворов экзополисахарида, используют культуральную жидкость Вас Поз раугпуха ВКПМ В, коагуляцию клеток в ней осуществляют путем распыли- тельной сушки при температуре сушильного агента на входе 105 - 115 С, полученный порошок диспергируют в воде, нагревают диспг.;рсию. до 80. - 100 С, выдерживают в течение 25 - 35 глин, сспарируют смесь и выделлют целевой продукт из жидкой фазы осаждением спиртом или ультрафильтрацией,2, Способ по п,1, о т л и ч а ю щ и Й с я тем, что, с целью увеличения тиксотропнасти растворов экзополисахарида, после сеи "ирования раствор подщелачиваютдо рН 1".0 и выдерживают в течение 25 - 35 мин г ри 80-100 С с последующей нейтрализацией раствора с выделением целевого продукта осаждением спиртом,1698293 Температура раствора, С Время нагрева раствора,мин Время растворения полупродукта,мин Температура сушильного агента на вхо е,С Пример Тиксотропность,сизводственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул. Га а,1 аказ 4368 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Рэушская наб., 4.5