Способ получения l фенилаланина

СООЭ СОВЕТСНИКСОЦИАЛИСТИЧЕСНИХРЕСА 1 УБЛИН 1380212 сится к микро енности и каменимой амино ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССРОО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИИ(7 1) Всесоюзный научно-исследова"тельский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов(57) .Изобретение отнбиологической промьвщсается получения нез 13/22 С 12 Ю 15/00. кислоты фенилаланина, которая при" меняется в медицине, а также мажет служить исходным продуктом прн син" тезе аспартама-пептида, испольэуемо" го в качестве интенсивного подслас" тителя в пищевой нромьпвленности. Целью ивобретения является повышение выхода Ь-Фенилаланина и сокращение времени Ферментации. Способ заключается Э использовании в качестве продуцентов Ь"Фенилаланина новых штаммов ВасИ 1 пв зиЬйх 11 в ВКПИ В 3549 или ВКПМ В, или ВКПИ В; или ВКПИ В, устойчивых к р"Фторфеиилаланину и О-тирозину. Штамм ВКПИ Вустойчив еще и коксаматам Фенилаланина и тирозина; а штамм ВКПИ В" к р"тиенщт аланину. Штаммом накапливают в сре" де от 8,6 до 13 г/л Ь"Феннлаланина.2 табл,Изобретение относится к микробиологической промышленности н касается способа получения незаменимойаминокислоты 1.-фенилаленина, которыйприменяется а медицине, а такжеможет служить исходным продуктомпри си 1,теэе аспартама-пептида, используемого.в качестве интенсивногоподсластителя в пищевой промьппленности,Целью изобретения является повышение выхода 1-феннлаланина и уско"рение процесса,Способ заключается в применении 15новых штампов Вас 111 цв вцЬЙ.1 дв,полученных с помощью генетическойтрансформации, мутагенеэа и отборамутантов, устойчивых к аналогам аро"матических аминокислот, а также к 20антибиотику митомнцину С.В качестве исходного штамма слу"жит штамм Вас. вцЬс 111 в 924 - проду 1, цент, триптофаиа, нэ которого полученпродуцент фенилаланина генетическими методамн на основе общности путейсинтеза ароматических аминокислоти того, что у продуцента триптофанав процессе селекции уже созданы определенные предпосылки и для сверх" 30синтеза фенилапанина. Исходный штамм924 трансформируют хромосомной ДНКдонорного штамма Вас, зцЬй 111 в 39в составе которой имеется дефектныйген гр. Е, кодирующий первый фермент в пути синтеза триптофана иген аго Н, который кодирует высокоактивный изофермент хоризматмутазу,отсутствующую у продуцента триптофана. В результате получают трансформанты, требующие для роста триптофан и имеющие высокий уровеньактивности хоризматмутазы. Срединнх после проверки на способностьпродуцировать фенилаланин отбираюттрансформант, накапливающий 3 г/лэтой аминокислоты, иэ которого путемселекции получают мутант, устойчиВый к 0,5 мкг/мл митомицина С и выделяющий 5 г/л фенилаланина. Следующие этапы отбора заключаются в последовательном получении (послевоздействия на клетки нитрозогуаиидина) мутантов, ус тойчивых к аналогам ароматических аминокислот: рфторфенилаланину (рФФ) в концентра"ции 9 мг/мл, Д"тирозину (ДТ)0,075 мг/мл, гидроксамату тирозина(ГТ) 1 мг/мл, гидроксамату фенилаланина (ГФ) 0,5 мг/мл, р-тиенилаланину (ТЕА) 7,5 мг/мл, В результате на разных этапах селекции получают штаммы Вас, вцЬ 1111 в ВНИИге"нетика 11 ВНИИгенетика 33, ВНИИге"нетика 1-11, От штамма Вас, вцЬс 111 в ВНИИгенетика П получен спонтанный ревертант к триптофаннезависимости прототрофный штамм ВНИИгенетика19 п,Перечисленные новые штаммы"продуценты 1 ".фенилаланина - Вас. вцЬс 11 в ВНИИгвнетика 11, Вас. вцЬй 111 вВНИИгенетика 33, Вас, вцЬй 111 в ВНИИ"генетика Х"11, Вас. вцЬС 111 в ВНИИге"нетика 19 п хранятся во Всесоюзноммузее промышленных микроорганизмов(ВКПИ) и имеют регистрационные номера В, В"3552, Ви В соответственно.Штаммы имеют следующие культурально"морфологическую и физиолого"биохимическую характеристики.Основные характеригики новыхштаммов Вас. вцЬс 111 в соответствуют таксономическому описанию этоговида микроорганизмов (Стейниер Р,и др. Иир микробов, т. 3, с. 184,ИИР, 1979),Штаммы Вас, вцЬС 3.11 в ВКПИ В,ВКПИ В, ВКПИ Ви ВКПМВявляются грамположительнымиспорообразующими палочками размером(2,5-4,5) 0,7 мкм. Размер спор (1,О 1,2) (0,6-0,7) мки.Иясо"пептонный агар, Колонии пос"ле 24 ч инкубации при 37 С достигают4-6 мм в диаметре, сплошные, круглые, с изрезанным краем, поверхностьгладкая.Агариэованная среда Спицайзена с100 мкг/мл триптофана и 10 мкг/младенина. Колонии после 48 ч инкубации при 37 С имеют 1 мм в диаметре,поверхность гладкая, блестящая.Отношение к источникам углерода:йспользуют глюкозу, сахарозу, мальто"зу, маннозу, маннит, глицерин, ацетат.Отношение к источникам азота: ас"симилируют мочевину и соли аммония.Не растут на молоке, желатинуразжижают слабо, хорошо растут накрахмалееОтношение к аналогам аминокислот: все штаммы устойчивы к р-фторфенилаланину (рФФ) и Дтирознну (ДТ),штамм ВКПИ В 3552 устойчив еще к(ТЕА).Потребность в факторах роста;рост всех штаммов стимулируется аденином, штаммы ВКЛМ В"3549, В и Втребуют для роста триптофан, штамм ВКПМ Вне требуетдля роста триптофан. Отличительныепризнаки штаммов представлены втабл, 1.В общем виде способ полученияЬ-фенилаланина осуществляют следую 15щим образом. Клетки новых штаммовпродуцентов Вас. ацЬ 11 з ВКПИВ, В"3550, В"3551 и В выращивают в течение 1 сут на агаризованной среде Хаттингера, пересевают в колбы со стерильной питательной средой, содержащей источникиуглерода, азота, ростовых веществ инеобходимые минеральные соли, и куль"тивируот в течение 18-24 ч на качалке 25при 220 об/мин и 28-37 С,Полученцьй посевной материал вносят.в колбы или ферментеры со стерильной питательной средой, содержащей источники углерода, азота, ростовых веществ и минеральные соли, Вкачестве источника углерода исполь- .зуют сахарозу или содержащие ее субстраты, например, технический сахар,в качестве источника азота - мочевииу или соли аммония, в качестве ростовых веществ - триптофан и кукурузный экстракт, Ферментацию осуществляют в течение 46"72 ч в условияхаэрации, при 28-37 С, рН 6-8, вколбах на качалке или в ферментере,при расходе продуваемого через культуральную жидкость воздуха 400 мл/мин,скорости вращения мешалки 1000 об/мин.В результате в культуральной жидкостинакапливается до 13 г/л Ь-фенилаланина.Определение содержания фенилаланина в культуральной жидкости проводят с помощью бумажной или тонкослойиой хроматографии в системах50растворителей бутанол; уксусная кислота:вода (40:10:23) и изопропанол:аммиак (7."3) соответственно,Выделение Ь-фенилаланина изкультуральной жидкости осуществля"ют путем его селективной сорбции наслабоосновном анионите с последующей десорбцией водой и повторной десорбцией из водного элн ата на сульфокатнонцте в Н-Форме (ат. св, СССРУ 749889). Злюирование 1.-феццлалацица и сульфокатионнта горячим водцоэтацольцым раствором аммиака получить высококонцентрироаццый раствор выделяемой аминокислоты, цэ которого последняя кристаллизуется помере охлаждения раствора и цейтралиэации аммиака кислотой.Выделение Ь-Фенилалациы по описанной схеме обеспечивает выход Фенцлаланина до 60-807, Содержание основного вещества в хроматографцчески однородном продукте состлляет цеменее 953. Дополнительна ц рекрцсталлизация позволяет получить препараты фецилгланина с содержаццемОсОвного вещества Ге менее 99,ъ.П р и м е р 1. Культуру штаммаВас. зъЬс.11 з Вкпм Г9 ьръшцваютв течение 1 Я ч при 37 С ка лгяризованной среде Хоттингера. Затем петлей засевают колбы объемом 250 ;н,содержалего 10-30 мл лосецой среды.Состав посевной средь, г/л; сахароза 1 кукуруз цъп экстрах0 1 К 1 РО 41,4; КН РО0,6, триптофац О, 1, водопроводцая ода до 1 л, р 11 до стерилизации 7,2-7,5, после ст рцлиэа"цил 7,0-7,2. Посевную среду стерилиэуют в автоклаве при 0,8 атм в течение 30 мин, После посса колбь ус"танавливают на круговую качалку(220 об/мин) и инкубируют при 30 Св течение 18 ч, Готовый посевной материал вносят в количестве 57 (пообъему) в колбы емкостью 2000 мп с75 мл ферментационной среды, Состав Ферментационной среды, г/л:сахароза 100; кукурузный экстракт30, К;НРО1,4; К,1 РО О, б; 11 а С 10,5; Мр 01,0, мочевица 5,0, триптофац 0,1, водопроводная ода до 1 л,рН среды ,2, Иочевину добаляютперед засевом в готовую среду в виде 403-ного раствора, простерилизованного при 0,5 атм в течении30 мин, После засева колбы устацав"ливают на качалку. Через 72 ч ростао,культуры при 30 С в культуральцойжидкости накапливается О г/л 1-Фецилллацина,целью выделения 1,-фецилаяац 1 ца1 л полученного ферментациоццогораствора пропускают через коленкус 0,4 л слабоосновного ацноцитаИАр. По окончании сорбцци колонкупроьп 1 ввют 0,3 л воды, ногче чего,подсоединив к выходу колонки с ИА 1 рколонку с 0,07 л супьфокатионитаКУ"8 в И"форме, пропускают воцууже через систему из двух колонок,После прохождения 9 л воды колонкиразъединяют, .-фенилвланнн, перешедший с анионита ИЛ-"1 р на катионитКУ"8, элюируют 2%-ным раствором 1 Оаммиака в 50%-ном водном эталоне при65 С, пропуская злюэнт через колонку с КУ"2"8. Фракцию выходящего раствора, содержащего .-Фенилапанин вконцентрации более 80 г/л, обрабатывают уксусной кислотой до рй 6,0и охлаждают. Выпаьшие кристаллы 1,"фенилаланина отфильтровывают, проювают этанолом и высушивают. В результате получают 6 О 7 г криствллического продукта. с содержанием Ь-фенилаланина 97% (выход 59,8%), Доиз"влечение целевого продукта из маточ"ика и низкоконцентрированных фракций аммиачного элюата по описанной 25вьиие схеме(предварительно нейтрализуют аммиак уксусной кислотой и от:"опяют этанол) позволяет получитьдополнительно 1,53 г кри .таллическо"о продукта (содержание основного . 1 Овещества 95%), с учетом которогообщий выход кристаллического 1,-фенилаланина составляет 7(.6%,П р и и е р 2. Вырагвлвание. посе в но го материала и к ультивиро ваннештамма Вас. впЬ 1хв ВКПР В"3550проводят, как в примере 1, но ферментационная среда содержит 130 г/лсахаровы. Через 72 ч в культуральнойжидкости накапливается 1 3 г/л феую 0нилаланина. Выделение фенилаланинанз 1 л культуральной жидкости осу"цествляют, какв примере 1: В результате получают 7,8 г кристаллического продукта с содержанием фенилаланина 96%. Выход кристаллического фенилаланина 663%. П р и м е р 3, Выращивание по"- "евного материала и куль гивирОвание штамма Вас, вцЬ 1 з.1 ь.в ВКП.1 Восуществляют, как в примере 1, Отли- чием является то, что посевная и ферментационная срецы не содержат триптофана, Через 72 ч кульгуральной жидкости накапливается 9,1 г/л фенилаланина Выделение фе" нилаланина из культуральиой жидкос-. ти осуществляют, как в примере 1,Выход кристаллического продукта 69,5%, содержание фенилаланина 96%,Н р и м е р 6, Посевной материал штаммов"продуцентов фенилаланина Вас, вцЬ 1.1 в ВКПМ В, В"3550, Ви Ввыращивают, как в примере 1. Готовым посевным материалом каждого штамма (20 мл) засевают АОО мл ферментационной среды того же состава, что и в примере 1, Для штамма ВКП 1 В"3551 среды не содер" жат триптофана. Культивирование ведут в лабораторнь 1 х ферментерах емкостью 600 мл при 30 С, расходе продуваемого через культуральную жидкость воздуха 400 мл в 1 мин, скорости вращения мешалки 1000 об/гун. Культивирование заканчивают, как только из питательной среды исчерпывается сахар, Результаты показаны в табл. 2. Выделение фенилаланина проводят, как в примере 1. Выход кристаллического продукта 77%, содержание фенилаланина 98%.П р и м е р 5. Посевной материал штамма Вас. вцЬ 1 х 1 ьв ВКП 1 И Ввыращивают, как в примере 1. Готовым посевным материалом (20 мл) засевают 400 мл ферментационной среДы тогО же состава, что и в примере 1, с тем отличием, что концентрация сахара в средеуменьшена до 6,5% и зместо мочевины внесено 0,5% сернокислого аммония.Культивирование ведут в лабораторном ферментере, оснащенном сис" темой автоматического рН-статироваОния, при 30 С, расходе продуваемого через культуральную жидкость воздуха 400 мл/мин скорости вращения мешалки 1 ООО об/мин, Значение рн культуральной жидкости поКцерживают на уровне 7,0+0,1. В ходе культивированин в ферментер по сигналу датчика рР добавляют смесь 40%-ного раст" вора сахарозы и 25%"ного раствора амниака в соотношении 10:1 по объе" му. Продолжительность культивирования 58 ч Уровень накопления фенилвланина составляет 11,1 г/л,Выделение фенилаланина ведут,как в примере 1. Выход кристаллического продукта 70%, содержание фенилсланина 98%.13802 2 Устойчи" Потребность Штамм вость к . в триптоаналогам фане ВКПИ Врфф, ДТ Нуждается ВКПИ Врфф, ДТ,Гф, ГТ Нуждается рфф, ДТ,ТЕА ВКПИ ВНуждается ВКПИ Врфф, ДТ Не нуждается фрфф - р-фторфеннлаланин;ДТ - Д"тирозин;Гф - гидроксамат фенилаланнна;ГТ - гидроксамат тирозина;ТЕА - а -тиенилаланинТаблица 2ейЮваее пааа Штамм Вас, ацЬйь 11 а ВКПИ 11.1Показатель ВВВВ"3552 Накопление фенилаланина, г/л 86 12,1 11,7 13,0 Продолжительность культнви."рования, ч 46 72 68 72 ВНИИПИ Заказ 4663 Тираж 361Подписное Произв,-полигр. пр-тие, г, Ужгород, ул. Проектная, 4 Предлагаемый способ отличается от прототипа более высоким уровнем образования фенилаланина " до 13 г/л (у прототипа 2,88 г/л), более корот" ким сроком ферментации " 46-72 ч (у прототипа 96 ч), на простых по составу средах, содержащих сахаро" зу, источники азота (мочевина или соли аммония), минеральные соли, а 1 О в качестве источника ростовых веществ - кукурузный экстракт и трир1 тофан, если используемый штамм нуждается в этой аминокислоте. При выделении фенилаланина из ферментационйого раствора выход составляет 60-803 кристаллического продукта. Формула изобретенияСпособ получения Ь-феннлаланнна, включающий выращивание продуцнрую" ших его штаммов Васд 11 цз заЬС 111 а в условиях аэрации на питательной среде, содержащей источники углеро" да, азота, минеральные соли и ростовые вещества, до максимального накопления целевого продукта с последующим его выделением, о т л и " ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения выхода целевого продукта и ускорения процесса, в качестве продуцентов используют штаммы ВКПМ В"3549 или ВКПМ В) или ВКПИ В, или ВКПИ В.Таблица