Реактив для турбидиметрического определения липазы

СОЮЗ аВЕ СО 1.1 ИА ЛИС СНИХ ЕСНИХ 8013 867 БЛИН4 с 01 и 33/ 2ГмбХ (ВЕ)арл-ВольфганАльберт Ренер Кремер (088.8)2350604,ой киство три- ктиватив об"остью водиов за ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТ ИСАНИЕ ИЗОБ(54) РЕАКТИВ ДЛЯ ТУРБИДИМЕТРИЧЕСКОГСОПРЕДЕЛЕНИЯ ЛИПАЗЫ(57) Изобретение относится к клинической биохимии, а именно к реактиву для определения липазы особеннотурбидиметрическим методом. Цельизобретения - повышение чувствительности реактива для определения липазы. Сухой реактив для турбидиметрического определения липазы содержитзащитный коллоид и жидкий триглицерид (в котором остатки жирных кислот имеют 8-20 углеродных атомов и 1-8 углерод-углеродных двойных связей). В качестве защитного коллоидаиспользуют мономерную пентозу илигексозу, или полимер, содержащий2-10 пентозных или гексозных групп,или твердый полиэтиленгликоль. Защитный коллоид включает также сахарный спирт, полиэтиленгликоль. Жидкийтриглицерид содержит также триолеин,глицерин-три-октаноин, глицерин три 2-октаноин, глицерин-три-тетраделаноин, глицерин-три,4,6,8-тетрадеканоин, глицерин-три-эйкозаноин. В качестве защитного коллоида реактивдополнительно содержит альбумин крупного рогатого скота. Реактив дополнительно содержит азид натрия, калиевую или натриевую соль желч лоты, колипазу, буферное вещ рН 6,0-10,0 из группы ди- ил этаноловых буферных веществ, тор (из группы хлоридов). Ре ладает повышенной чувствител и имеет более высокую воспрои мость и стабильность результа счет стабилизации экстинции п тометрическом измерении.30 В качестве триглицерида используют как естественные, так и синтетиче ские триглицериды с остатками жирных кислот между 4 и 22 С-атомами. Пригодным является также трибутирин, Наиболее предпочтительны триглицериды с длинноцепочечными остатками ненасыщенных жирных кислот, в особенности триглицериды, остатки жирных кислот которых имеют 8-20 С - атомов и 1-8, преимущественно 1-3, углерод-углерод двойных связей. Благодаря легкой дос- о тупности особенно предпочтительным является триолеин, также можно использовать оливковое масло. Предпочтительное количество триглицерида составляет 0,2-2,0 мас.7.55В качестве защитного коллоида используют полигидроксисоединения, сывороточный альбумин, поливинилпирролидон, твердые полиэтиленоксиды. Изобретение относится к клиничес".,кой биохимии, а именно к реактивудля определения липазы особенно турбидиметрическим методом.Цель изобретения - повышение чувствительности реактива для определения липазы,Способ осуществляется следующимобразом, 10.Сухой реактив для турбидиметрического определения липазы, содержащийзащитный коллоид и жидкий триглицерид, при этом в качестве защитногоколлоида содержит мономерную пентоэу или гексозу, или полимер, содержащий 2-10 пентозных нли гексозныхгрупп, или твердый полиэтипенгликоль,в качестве жидкого триглицерида используют такой, в котором остатки 20жирных кислот имеют 8-20 углеродныхатомов и 1-8 углерод-углеродных двойных связей, дополнительно содержитазид щелочного металла, калиевуюсоль желчной кислоты, колипазу, мочевину, буферное вещество рН 6,0 приследующем соотношении компонентовЖидкий триглицерид 0,47-6,58Калиевая сольжелчной кислоты 13,5-34,4Колипаза 0,0065-0,05Азид щелочногометалла 0,36-0,87Иочевина 3,82-28,29Буферное вещество 4,85-12,6Активатор 0,22-3,25Защитный коллоид Остальное Предпочтительными примерами пригодных полигидроксисоединений являются маннит и подобные многоатомныеспирты, олигосахарид глюкозы, манноза, мальтогептоза, полиэтиленгликольсо средним молекулярным весом между3500 и 7000 и др.Защитными коллоидами являются такие аминокислоты, как алании, а также гуммиарабик. Предпочтительным количеством защитного коллоида соответственно смеси защитных коллоидов является 50-70 мас,7., В качестве особенно пригодной оказалась смесь сахарного спирта и полиалкиленгликоля.В качестве желчных кислот принимаются во внимание известные поверхностно-активные желчные кислоты, какхолевая кислота, таурохолевая кислота, дезоксихолевая кислота соответственно их соли щелочных металлов,в особенности натриевая соль. Предпочтительное количество составляет10-15 мас.Х.Дальнейшей существенной составной частью предлагаемого реактиваявляется колипаза. Особенно пригодной является свободная от примесейколипаза. Предпочтительное количество составляет 0,003-001 мас.Ж.В качестве консервантов используют такие, которые не нарушают ферментативную активность подлежащейопределению липазы. Особенно пригодными являются азиды щелочных металлов, в особенности аэид натрия. Однако пригодными являются также другие консерванты, как например тиозид, и другие серосодержащие консерванты. Предпочтительное количествоконсерванта составляет 0,2-0,7 мас,Х.Реагент содержит еще мочевину,предпочтительно 10-15 мас.7,В качестве буферного вещества пригодны все известные буферы, которыев состоянии в рамках предлагаемого,реактива устанавливать рН между 0,6и 10,5, Предпочтительная область рНмежду 8,3 и 9,5. Примерами пригодного буфера являются диэтаноламинныйбуфер, триэтаноламииный буфер, ТгЫбуфер и Соотг-буфер, как Нерея-буфер(пригоден для добавки перед лиофилизацией), Тарз"буфер и Вхспе. Предпочтительным является Тге-буфер.Предпочтительное количество буфера3 и 1 О мас.Х. Дальнейшим активато"ром являются ионы кальция. Так как1367867 4к лиофилизату непосредственно послеего получения или немного позднее.П р и м е р . 0,06 г СаС 122,72 г дезоксихолата натрия, 25,35 гполиэтиленгликоля с молекулярным весом 4000, 1,1 г азида натрия, 0,02 гколипаэы и 50,8 г маннита растворяютв 1,0 л дистиллированной воды, В полученный раствор при перемешивании сдавлением 2 бара через сопло диаметром 1,5 мм впрыскивают 1,42 г триоленина, растворенные в 32 мл н-пропано"ла. Полученную триолеиновую эмульсиюзамораживаит при -40 С и сушат путемлиоАилизации.8,95 г дезоксихолата натрия,7,25 г Тгз) 1,20 г Тгз-НС 1, 7,5 гполиэтиленгликоля с молекулярным весом 4000, 1,97 г ИаС 1, 16,2 г мочевины и 56,9 г маннита смешивают друг сдругом в сухом состоянии, 2 мас.ч,полученной буферной смеси с помощьюспирального смесителя смешивают с1 мас.ч. лиофилизата в гомогенный реактив.Для проведения определения липазык 150 мг этого реактива добавляют2,5 мл воды, смешивают с 0,1 мл пробы и фотометрически измеряют при365 нм при 25 С по отношении к воде,В качестве пробы пригодными являются,например, сыворотка крови, содержимое двенадцатиперстной кишки, моча идругие жидкости организма,Правильность метода проверяют путем сравнения с титраметрическим методом по Рикку. При изучении 60 серийчеловеческой липазы различной активности получались следующие данные:корреляция: (х = Рикк, у - тест согласно изобретению) у = 0,93, х г,96.Линейность теста остается получающейся до примерно 1300 единиц по РиккуОдна единица по Рикку = 1 мольУРА/мин = 1 ч. РГА - высвобождающиесяжирные кислоты. они с дезоксихолевой кислотой дают нерастворимые соединения, в присутствии кальция в качестве желчной кислоты предпочтительной является тауро 5 дезоксихолевая кислота, так как она допускает более высокие концентрации кальция в области 1-5 ммоль.Предлагаемый реактчв содержит также активатор для липазы. Активаторы О липазы являются известными. Предпоччительными являются хлориды, в особенности хлорид натрия, но также другие хлориды щелочных или щелочно- земельных металлов, поскольку они 5 не ведут к образовании нерастворимых соединений с другими составными частями реактива или пробы. Активируище действуют также ионы магния.Сухой реактив получаит путем лио- И филизации одной из составных частей эмульсии, полученной обычным методом. При этом буферное вещество, мочевина и в данном случае также часть защитного коллоида и консерванта, а также активатора преимущественно добавляют к "сухой эмульсии" лишь после лиофилизации. 1 одвергнутая лиофилизации эмульсия может почучаться обычным методом, например путем внесения 30 всех составных частей в водный растворитель, эмульгирования с помощью обычных методов, как ультразвук и т,п. и в заключение замерзания присоколо -40 С и сушки в вакууме при обычных условиях (10 - О торр). При лиофилизации должны быть добавлены соль желчных кислот, колипаза, минимум 20 мас.Е защитного коллоида, 40 минимум часть консерванта и в данном случае активатор, Предпочтительный способ получения водной эмуль сии, определенной для лиофилизации, состоит в том, что названные составные части, исключая триглицерид, растворяют в воде и затем при перемешивании в раствор сильной струей впрыскивают раствор триглицерида в летучем органическом растворителе, 50 В качестве летучего органического растворителя при этом пригодны в особенности алифатические спирты и кетоны с числом углеродных атомов 1-4.Остальные составные части предлагаемого реактива, а именно буферное вещество, мочевина и в данном случае остальной защитный коллоид, консервант и активатор, могут добавляться П р и м е р 2, 1,500 г маннита 0,900 г полиэтиленгликоля с молекулярным весом 4000, 0,524 г дезоксихолата натрия, 1,5.мл колипазы и 8 мг азида натрия растворяют в 50 мл дис- тиллированной воды. В этот раствор при перемешивании через мелкое сопла впрыскивают 150 мг триолеина, растворенные в 5,0 мл пропанола. Полу136786 6,5856,05 ченную эмульсию замораживают при-40 С и лиоФилизируют.350 г мочевины, 3,73 г дезоксихолата натрия, 0,40 г МаС 1, 0,10 газида натрия, 2 мг карбоната кальция,2,355 г Тгхя и 0,200 г Тгхя-НС 1 интенсивно перемешивают друг с другом.К этому добавляют измельченный сухойлиофилизат и гомогенно перемешивают. 1 ОКомплексная смесь = 8,219 г содержит: маннит 1,500 г; полиэткпенгликоль 0,900 г сумма = 2,4 г == 42,5 мас.%.37 мг этой смеси растворяют в 2 О2,5 мл дистиллированной воды и Фотометрически измеряют с 200 мл пробы(сыворотки) при 340 нм и 25 или 30 Спо отношению к воде или воздуху. Изразности ослабления в минутах проводят определение активности липазы.П р и м е р 3. 8,41 г альбуминасыворотки крупного рогатого скота,12,2 г дезоксихолата натрия, 0,02 газида натрия и 0,034 г колипазы раст- ЗОворяют в 100 мл дистиллированной воды. При перемешивании в этот растворпод давлением впрыскивают раствор3,5 г триолеина в 7 мл пропанола.Полученную эмульсию замораживают при-40 С и лиоФилизируют.17,4 г маннита, 4 г полиэтиленгликоля твердого, 7 г мочевины,7,47 г дезоксихолата натрия, 0,82 гИаС 3., 0,2 г азида натрия, 2,71 г40Тгхя и 0,4 г Тгя-НС 1 размалывают иинтенсивно смешивают друг с другом.К этому добавляют измельченную сухуюэмульсию и все гомогенно перемешивают. 4590 мг этого порошкообразного реактива добавляют в 2 мл дистиллированной воды и после растворения смешивают со 100 мл пробы (сыворотки).Реакция проводится при 340 (365) нмН Фотометрически. П р и м е р 4. .8,41 г аланина, 1,22 г дезоксихолата натрия,0,02 г азида натрия и 0,034 г колипазы растворя ют в 100 мп дистиллированной воды,при перемешивании в этот раствор под давлением впрыскивают раствор 3,5 г триолеина в 7 мл пропанола. Полученную 76эмульсию замораживают при -40 фС и лио Филиз ируют.17,4 г,маннита, 4 г твердого полиэтиленгликоля, 7 г мочевины, 7,47 г дезоксихолата натрия, 0,82 г БаС 1, 0,2 г азида натрия, 2,71 г Тгя и 0,4 г Тгхя-НС 1 измельчают и интенсивно смешивают друг с другом. К это" му добавляют измельченную сухую эмульсию и гомогенно перемешивают.90 мг этого порошкообразного реактива добавляют в 2 мл дистиллированной воды и после растворения смешивают со 100 мл пробы (сыворотки), Реакцию проводят при 340 (365) нм Н Фотометрически.П р и м е р 5. 4,205 г полиэтиленгликоля с молекулярным весом 4000, 4,205 г альбумина сыворотки крупного рогатого скота, 1,22 г дезоксихолата натрия, 0,02 г азида натрия и 0,034 г колипазы растворяют в 100 мл дистиллированной воды. При перемешивании в этот раствор под давлением впрыскивают раствор 3,5 г триоленина и 7 мл пропанола. Полученную эмульсию замораживают при -40 С и лиоФилизируют.17,4 г маннита, 4 г полиэтиленгликоля с молекулярным весом 4000, 7 г . мочевины, 7,47 г дезоксихолата натрия, 0,82 г БаС 1, 0,2 г азида натрия, 2,71 г Тгя и 0,4 Тгя-НС 1 измельчают и интенсивно смешивают друг с другом, К этому добавляют измельченную сухую эмульсию и гомогенно перемешивают,90 мл этого порошкообразного реактива добавляют в 2 мл дистиллированной воды и после растворения смешивают со 100 мл пробы (сыворотки). Реакцию проводят Фотометрически при 340 (365) нм Н.П р и м е р 6. Рецептура дана в мас.%:Триглицерид 0,47Защитный коллоид 68,00Калиевая сольжелчной кислоты 13,48Колипаз а 0,0066Азид щелочногометалла 0,36Иочевина 10,75БуФерное вещество5,61Активатор 1,33П р и м е р 7. Рецептура дана в мас.%:ТриглицеридЗащитный коллоид13678 Формула изобретения 0,36-0,87 4,85-12,6 0,22-3,25Остальное Составитель Л.КонюховаРедактор Н.Киштулинец Техред А.Кравчук Корректор М.Пожо Заказ 6856/58 Тираж 847 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5 Производственно-полиграфическое предприятие, г. ужгород, ул. Проектная, 4 Калиевая сольжелчной кислоты 16,34Колипаза 0,06Азид щелочногометалла 0,41Мочевина 13,16Буферное вещество 5,85Активатор 1,54Предлагаемый реактив обладает бо лее высокой чувствительностью в сравнении с известным, а также имеет более высокую воспроиэводимость и стабильность результатов за счет стаби-лизации экстинкции при фотометрическом измерении. Реактив для турбидиметрического 20 определения липазы, содержащий в качестве защитного коллоида пентозу, гексозу, сахарный спирт, полиэтиленгликоль или их смесь и жидкий триглицерид, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения чувствительности реактива, в качестве жидкого триглицерида реактив содержит триоле 67 8ин, глицерин-три-октаноин, глицерин три-октаноин глицерин-три"тетра" деланоин, глицерин-три,4,6,8-тетрадеканоин, глицерин-три-эйкозаноин или глицерин-три,4,6,8,10,12,14,16- эйкозаноин, в качестве защитного коллоида дополнительно содержит альбумин крупного рогатого скота, и кроме того, реактив дополнительно содержит азид натрия, калиевую или натриевую соль желчной кислоты, колипазу, бу-, ферное вещество рН 6,0-10,0, выб" ранное из группы; ди- ипи три-этаноловых буферных веществ, активатор, выбранный из группы: хлористая соль натрия, кальция или магния, при следующем соотношении компонентов,мас.7.:Жидкий триглицерид 0,47-6,58Калиевая сольжелчной кислоты 13,5-34,4Колипаза 0,0065-0,05Мочевина 3,82-28,3Азид щелочногометаллаБуферное веществоАктиваторЗащитный коллоид