Способ получения раствора красителя для маркирования биологической жидкости

) Филиал арственн по биологи довательскогческим испытнений и Научинститут по ских соедительский ниям хи но-цсследов биологическ м испытания ОРА КРАСИГИЧЕСКОЙ етеро частност еля (РК) скои жид- применеОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИИ К АВТОРСКОМУ С химических соединении(54) СПОСОБ 11 ОЛУЧЕНИЯ РАСТВТЕЛЯ ДЛЯ МАРКИРОВАНИЯ БИОЛОЖИДКО СТИ(57) Изобретение относитсяциклическим соединениям, вк получению раствора краситдля маркирования биологичекости, который может найти ние в медицине. Улучшение качестваРК и расширение сферы его применениядостигаются использованием другогореагента и проведением процесса вдругих условиях, Получение РК ведутиз фпуоресцина и йодида щелочного металла при молярном соотношении 1; 2,04,5 в водно-солевом растворе в электрохимической ячейке при рН 6,0-8,0и постоянной величине ацодного потенциала, Данный способ позволяет повысить качества целевого РК, что даетвозможность использовать его непосредственно для биологических исследований, В сравнении с известным полученный РК имеет лучшую оптическуюплотность (на 207) при одинаковойконцентрации, Кроме того, РК позволяет получать флуоресцеиновые красители, меченные радионуклидами йода.2 табл, 1325057Изобретение относится к способуполучения раствора красителя для маркирования биологической жидкости, который может найти применение в медицице,Цель изобретения - улучшение качества целевого продукта и расширение сферы его применения,Указанная цель достигается засчет взаимодействия флуоресцина сйодидом щелочного металла при соот 10 ветствующгх значениях реагентов, величинах рН и постоянном значении анодного потенциала, 15П р и м е р 1, В электролизер сплатиновыми электродами вносят 10 ЗМФлуоресцина в 5 мл 0,1 М фосфатногобуферного раствора с рН 7,0, содержащего 0,9 хлористого натрия и 4,5О Г 1 йодида калия (молярное соотношение йодид калия: флуоресцин4,5:1). Процесс электролиза проводятпри величине анодного потенциала0,5 В в течение 1 ч, Выход красителя 25йодированного флуоресцеина 97 .,Выход целевого продукта определяют спектрофотометрически по снижениюэкстинкции длинноволновой полосы исходного красителя ияи методом радиоактивных индикаторов с использованиемрадионуклидов 131 пли 125,.П р и м е р 2. Йодирование флуоресцина проводят аналогично примеру1, но в качеств йодсодержащего реагепта используют 40 МБк натрий йодистого (йод - 125). Для определениявыхода красителя по окончании электролиза пробу реакционной смеси наносят на полоску ацетатцеллюлозной 40пленки, Пленку помещают в ванну электрофоретического прибора и проводятэлектрофорез в течение 15 мин в 0,2 Мборатном буфере с рН 8,0 при 350 В.Идентификацию радиоактивных веществ 45на электрофореграмме осуществляют методом авторадиографии, Лктивность полос определяют на гамма-счетчике,Гезультаты опытов приведены втабл,1.50П р и м е р ы 3-5, Процесс осуществляют аналогично примеру 1 придругих соотношениях реагентов,П р и м е р 6, В электролиэер помещают 10 мг аминофлуоресцина (2,910М) в 8 мл 0,2 М трис-НС. буферного раствора с рН 7,6 и 0,1 Мйодида натрия (молярное соотношениецодид натрия: аминофлуоресцин 2,0:1 ),Электролиз проводят 50 мин при величине потенциала платинового анода 0,53 В. Выход 99 .П р и м е р ы 7, 8, Процесс осуществляют аналогично примеру 6 придругих соотношениях реагентов,Выбор диапазона рН 6,0-8,0 связанс необходимостью достижения диссоциации фенольного гидроксила молекулыфлуоресцина, При значении рН меньшеуказанного диапазона снижается скорость реакции, а увеличение рН (больше 8,0) небезопасно для биологических объектов, Кроме того, при рН,большем, чем 10,0, возможно протекание побочных процессов, В качествеводно-солевых растворов для проведения процесса могут быть использованынеорганические буферные растворы,имеющие рН в указанном диапазоне,Оптимальным является применение фосфатных буферных растворов с величиной.рН 7,0-7,6.В предлагаемом способе испольэуетгся молярное соотношение йодид щелочного металла: флуоресцин, равное 2,04,5;1,0, При соотношении меньшем,чем 2,0;1,0, часть исходного флуоресцина остается непрореагировавшей,что приводит к снижению выхода целевого продукта, а увеличение соотношения (больше 4 5:1,0) нецелесообразно, вследствие невозможйости введения в молекулу флуоресцина более 4,0атомов йода,В качестве йодидов щелочного металла предпочтительнее йодиды натрияи калия, так как ионы натрия и калияне изменяют свойств биологическихобъектов,В укаэанных солях йодид-ион можетбыть радиоактивным. Получение радиоактивного целевого продукта расширяет сферу его применения в биологических исследованиях,Биологические испытания красителей,Полученные растворы красителеймогут быть использованы непосредственно (беэ дополнительной очистки ивыделения) в биологических исследованиях,раствор радиоактивного красителя,полученный предлагаемым способом сприменением в качестве йодсодержащего реагента йодистого натрия, меченного 25 используют в биологических исследованияхИсследования про1325057 40 45 50 водят цд белых беспородных крысах,Раствор красителя вводят в хвостовуюнецу, Через определенные промежуткивремени определяют содержание краси 5теля н крови, моче и почках, Необходимость использования радиоактивногораствора красителя н данном случаевызвана невозможностью точного количественного определения красителя нтаких биологических объектах, кдкмоча, почка, печень, желчь оптическими методами.Крысам н хвостовую вену вводятО,1 мл раствора красителя, полученного по примеру 2, концентрацией1 мг/мл, удельная радиоактивность38 МБк/мл. Через 5, 5, 30, 60, 180мин животных (по 3 шт.) забивают декапитацией и определяют содержание 20радиоактивности н интересующих органах и тканях (кровь печень, почки,моча), Радиоактивность определяютметодом прямой радиометрии, Содержание красителя (7 от введенной внутринецно дозы) в крови, мочи, печени ипочках крыс н разные сроки послеинъекции (краситель получают по примеру 2) приведено н табл.2,Данные табл.2 свидетельствуют оноэможности использования растворакрасителя беэ его дополнительнойочистки для изучения процесса проницаемости почечных мембран,Для цитологических исследований,35оснонацных на оптических методахопределения красителя, можно применять нерадиоактивцый раствор красителя,В условиях предлагаемого способаполучают окрашенные йодпроизводнымифлуоресцеицоными красителями полисахариды различной молекулярной массы.По данным гельфильграции на ультрагелях в процессе их получения не отмечают изменения молекулярной массыполисахдридон. Максимумы поглощенияисходного и нолучеццого окрашенныхполисахдридов отличаются ца 9-33 нм(490 цм - оранжевый, 510-525 нмкрасный), н зависимости от степенийодиронация,В присутствии радионуклида йод -125 получают радиоактивные полисахариды, окрашецные флуорестп ицонымцкрасителями, которые используют дляизучения цх фдрмакокццетцлц н Лозах0,5-0 мг/кг веса животных, 11 зучение фармакокицетики цолисдхдридов,вводимых в указанных дозах инымиспособами, кроме использования меченных радионуклидами образцон, практически невозможно,При введении раствора красителяэритрозина В , полученного по известному способу той же концентрации вхвостовую вену крысам около 50 Х животных погибают в течение получаса,следовательцо, непосредственно использование этих растворов (беэ дополнительной очистки) для биологических исследований невозможцо,Таким образом, использование предлагаемого способа получения рдстнорон красителей обеспечивает улучшение качества целевого продукта, которое выражается в возможности непосредственного использования растворов красителя для биологических исследонаний а также н большей (на202) оптической плотности растворовкрасителей, по сравнению с известнымспособом при одинаковой концентрации,расширение сферы применения красителей в биологических исследованиях,которое выражается в воэможности получения флуоресцеиновых красителей,меченных радионуклидами йода,формула изобретения Способ получения раствора красителя для маркирования биологической жидкости путем взаимодействия флуоресцина с йодсодержашим реагецтом в водно-соленом растворе в электрохимической ячейке, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью улучшения качества целевого продукта и расширения сферы его применения, в качестве йодсодержащего реагента используют йодид щелочного металла лри молярном соотношении флуоресцина и йодида щелочного металла 1:20- 4,5 соответственно и взаимодействие осуществляют при рН 6,0-8,0 и постоянной величине анодного потенциала,)х 3 х Ц о х о 1 1 сЧ М - Л 0 Л а 1 о о о о 1 ХОо Е 1 х 1 о х х Й .о х х о о х Е о1 )х о х о Э о И Ю Ц Ц Эх о Щ а 1" Ц Э а 1" о 1-" о ох цЭ оо х мхоп 3 -о аК сй О 1 о од охох сох ох-оооа д Э Э с ха1-хе х х Го Э а 1 о е О л О м л -т л о д о В Фв В О О О О О О О и 0 О В ФВ в ссО л л со Я- -4 1 С 3о о . хх х а8 ао о о 6 1х х О 1а а 8ЕЕ Е Е1ОЮЮО О О О х х 1 о Э а о 3 1 о х х1 325057 Таблица 2 Объект Содержание красителя, 7 от введенной внутривенно дозы через мпн15 30 60 5180 42,2 21,0 34, 8 15,6 5,3 40,7 23,1 34,8 23,1 5,3 41,0 21,7 29,9 18,6 5,6 23,7 15,7 17)8 7,6 7,6 21,5 15,9 20)6 14,2 4,9 26,6 14,1 16,4 11,6 7,27,5 5,0 6)6 4,5 8)4 7,2 5,7 6,6 4,4 3,0 7,7 4,8 5,7 5,0 4,4 Кровь Печень Почки Моча 7,8 10,7 22,6 22,4 3,8 8,8 25,3 40,0 36 8 8 17,1 28 9 Составитель И)ДьяченкоРедактор П,унько Техред И.Попович Корректор Е,Рошко Заказ 3019/2 3 Тираж 633 Подписное 111 о сударстве нного комитета СССР ио делам изобретений и открытий 11 1015 Москва, Ж) Раущская наб д. 4/5