Способ определения аденозинмонофосфата в ткани мозга

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИРЕСПУБЛИК Т СССРОТНРЫТИИ СА ИЗОБРЕТЕНИ ВТОРСНОМУ СВИ(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АДЕНОЗИНМОНО ФОСФАТА В ТКАНИ МОЗГА(57) Изобретение относится к биохимии, а именно к биоэнергетике, предназначено для определения концентрации аденозинмонофосфата (АМФ) при АТФ;ы,гиполние временигипоксиниюсловиях нии и по сод пребывания ческом состАТФ с учетогипокси цию АМФ,та СУДАРСТВЕННЫЙ НОМО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ О 1302198 комплексномизучении аденозинтри та (АТФ).Цель изобретения - упрощ способа путем сокращения числа ст при определении аденеиловых нукле дов,Для этогоопределяют АТФ в тка з га, рассчитывают концентрацию АМ математической Формуле у = 9. х + х+ Ух+ Ч где у центрация АМФ; х - концентрация У , У, У, Ч - постоянные величиоф ф йф 3В случае применения способа при ксическом воздействии нужно доп тельное деиствие - измерен (с) пребывания животного в и определяют концен 1 з,п,ф-лы.-17,4808960,257653 1,660693 1,627649 концентрация АМФ;экспериментально полученное содержание АТФ;эмпирические коэффициенты функции щ И)1указанные в таблицах;время пребывания в состоянии гипоксии,А ,А ,А ля функй гипок3, при гиг обаричв табл,л 4.Т а б Значения ч. (С) при представлен мии - в таб 341496621,79449 22,551407 21,7944 621,7944 -15,9559 484 е ч а н и е. Атмосферное давление 270-290 мм рт,ст,Изобретение относится к биохимии,а именно к биоэнергетике, и может использоваться для определения концентрации аденозинмонофосфата (АИФ) прикомплексном изучении содержания 5аденозинтрифосфата (АТФ),Цель изобретения - упрощение способа за счет сокращения числа стадийпри комплексном определении аденеиловых нуклеотидов.Способ осуществляют следующимобразом,Проводят прижизненную фиксацию мозга мгновенным замораживанием, определяют содержание АТФ в ткани мозга5любым известным методом, а затем рас-считывают концентрацию АМФ по математической формуле у Юх + Ч + Ю +Т, (1) 20где у " концентрация АМФ;х - концентрация АТФ;о 11Р Чэ - постоянные величины ,В случае применения предлагаемогоспособа у интак тных животных функциипринимают постоянныезначения , укаэанные в табл, 1Таблица 1 В случае применения предлагаемого способа при гипоксическом воздействии требуется дополнительное действие - измерение времени пребывания животного в гипоксическом состоянии и расчет переменной функции 9 (г.) по1 эмпирическим коэффициентам А ,А ,Аоф 1 2 ф выбранным из соответствующих таблиц, При этом формула принимает вид: у = Ч,(С)х + Ч (с)х+ у (С)х +-4,7790863 А,. Ч,(с) А 0,5686278 4,8439768оА 2477)9 1266)69А -Оу 2775826 1,9613424 П р и м е р Г, Берут интактноеживотное (крысу-весом 170 г) и целиком замораживают в жидком азоте,Замороженный мозг извлекают и растирают в порошок в ступке с жидкимазотом. Навеску ткани берут в предварительно тарированный бюкс, содержащий слегка замороженный 10 -ныйраствор трихлоруксусной кислоты,приготовленный на 0,5 М ЭДТА из расчета 10 мл/г ткани. Пробу экстрагируют в течение 20 мин и фильтруют 25через бумажный фильтр. Трихлоруксусную кислоту удаляют трехкратнымвстряхиванием с двумя объемами серного эфира, насыщенного водой. Следыэфира удаляют аэрацией. Экстрактнейтрализуют до рН 7,0 - 7,4 0,1 н.раствором ЙаОН, Содержание АТФ определяют любым известным методом,В данном случае использован методколоночной хроматографии на эктеолацеллюлозе в С 1 -форме.С колонки АТФэлюируется 0,05 н, раствором НС 1 .Затем конечную концентрацию НС 1 доводят до 1,0 н. Оптическую плотностьизмеряют на спектрофотометре при 40длине волн 260 - 290 нм. Содержание АТФвыражают в мкМ на 1 г сырой тканимозга, Экспериментально установленное содержание АТФ в мозгу испытуемого животного равно 2,08 мкМ/г.45Выбирают из табл,1 значения функцийф,(С), Ч (Т), У (й), У (с) и подставляют в формулу (1) .Рассчитывают концентрацию АМФ:у = 0,26137752, Аналитически рассчитанное значение концентрации АМФравно 0,26137752, Экспериментальноустановленная концентрация АМФ вмозгу крыс в данных условиях равнаО, 27+0, 02, Ошибка формулы составляет 3,19 . П р и м е р 2, Берут интактное животное (кролик весом 2,6 кг). Про изводят прижизненную фиксацию мозгазамораживанием в жидком азоте, Готовят экстракт мозга (с охлаждением)и определяют содержание АТФ хроматографическим методом на эктеола-целлюлозе, Экспериментально установленное содержание АТФ в мозгу испытуемого животного равно 1,76 мкМ/г, Выбирают из табл,1 значения функцийЧ,(С), М (С), Ч (С), М (й) и подставляют в формулу, Рассчитывают концентрацию АМФ; у : 0,2106.178. Аналитически рассчитанное значение концентрации АМФ равно 0,2106178. Экспериментально установленная концентрацияАМФ в мозгу равна 0,22 ф 0,019. Ошибка формулы составляет 4,263.9.(с) = А+ Я соз(-), (3)А1где у - содержание АТФ;х - концентрация АМФ;с - время, мин;АА эА - коэффициенты линии регрессиию, .П р и м е р 3, Помещают животное.(кролик весом 2,7 кг) в проточнуюбарокамеру, путем разрежения воздухадостигают атмосферного давления270 мм рт.ст., что соответствует высоте 8000 м, Измеряют время пребывания животного на "высоте" 8000 м 15 мин. После извлечения животного из барокамеры производят прижизненную фиксацию мозга замораживаиием в жидком азоте, Готовят экстракт мозга (с охлаждением) и определяют содержание АТФ хроматографическим методомна эктеола-целлюлозе, Эксперименталь но установленное содержание АТФ в мозгу испытуемого животного равно 1;45 мкИ/г. Выбирают из табл.3 значения коэффициентов ААА, для соответствующего расчета функций , Ч (т), э(С)Рассчитывают по формуле ;(с) = А ++ А соз (- д ) соотв етствующие знаочения сР(с),= 0,1,2,3.Рассчитывают Р (с) при е = 150Значения коэффициентов А, = 5= -1,252948; А, = 621,79449; А = 1015 ь 95592 э ,(с) = -14,930578.Рассчитывают з (с) при с = 15Значения коэффициентов А =1,760388; А, = 621,79449," А22,551407; р (с) = 21,110 Ь, 152Рассчитывают Ч (с) при с = 15,Значения коэффициентов А, = 0,815949;А, = 621,79449; Ац = 9,061891;М (с) = -9,7296228Экспериментальное значение АТф и 20рассчитанные значения Функций(с),(с), 2(с), Р (с) подставляюти формулу (2) и вычисляют концентрацию АМФ, соответствующую данным условиям опыта (степень разрежения атмосферы в барокамере соответствует8000 м, время пребывания животногов барокамере 15 ), у = У,(Е)х +, (с)3,5598801; У, (с)14930578 е Ч (с) = 21 ф 1107941М (с) = -9,296228, у = 0,342228,Аналитически рассчитанное значениеконцентрации АМФ равно 0,342228Экспериментально установленноеколичество АМФ в мозгу животногов данных условиях опыта равно 0,35"0,044. Ошибка формулы составляет2, 27П р и м е р 4, Помещают животное 40(кролик весом 2,8 кг) в проточнуюбарокамеру, путем разрежения воздухадостигают атмосферного давления310 мм рт,ст что соответствует высоте 7000 м, Измеряют время пребывания животного на высоте 7000 м (60мин). После извлечения животного избарокамеры производят прижизненнуюфиксацию мозга замораживанием в жидком азоте. Готовят экстракт мозга 50(с охлаждением) и определяют содержание АТФ хроматографическим методомна эктеола-целлюлозе, Экспериментально установленное содержание-ЛТФ вмозгу испытуемого животного равно 551,85 мкМ/г, Выбирают из табл,2 значения коэффициентов А ,А А для соотУ 1 9 дветствующего расчета Функций з (с),Ч(С), (С), Ч (С), Рассчитывают 8 бв Апо Формуле Ч;(с) = А, + А, соэ(")соответствующие значения 1;(Е),= -.7,567743; М (с) = 0,0031848.Экспериментальное значение АТФрассчитанные значения Функций ф, (с),(с), у(с), М (с) подставляютв Формулу (2) и вычисляют концентрацию АМФ, соответствующую даннымусловиям опыта (степень разреженияатмосферы в барокамере соответствует7000 м, время пребывания животногов барокамере с = 60 ): у = У,(с)х += 0,084896; . (с) = -0,35071;У (с) = 0,0031848; у = 0,20605645,Аналитически рассчитанное значение концентрации АМФ равно0,20605645,Экспериментально установленноеколичество АМФ в мозгу животного вданных условиях опыта равно 0,19 +(крысу весом 180 г), дают легкийэфирный наркоз, делают перевязку правой и левой сонных артерий, Измеряютвремя пребывания животного в условиях ишемии - 240 мин. Крысу целикомбыстро замораживают в жидком азоте,Готовят экстракт мозга (с охлажденкием) и определяют содержание АТФхроматографическим методом на эктеола-целлюлозе, Экспериментально установленное содержание АТФ в мозгуиспытуемого животного равно2,13 мкМ/г. Выбирают из табл,4 значения коэффициентов А А., Л длясоответствующего расчета ФункцийР (с) М,(с), М(с), ф,с). Рассчит 1 вают по формуле Е (с) = АА хАх соз (- ) соответс твуюшие значенияс1302198 У =9,Составитель Н,ГуляеваРедактор Н,Тупица Техред И.Пспович,Корректор С,Шекмар Заказ 1212/44 Тираж 777 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д.4/5= -1,8941859; Р (с) = -2,0786331,Экспериментальное значение АТФ и рассчитанные значения функций Ч,(с),(с), (с) Ч (с) подставляют вформулу (2) и вычисляют концентрацию 20АМФ, соответствующую данным условиямопыта (перевязка правой и левой сонных артерий; время после операциис = 240) у = .0,2629956.Аналитически рассчитанное значение концентрации АМФ равно 0,2629956,Экспериментально установленноеколичество АМФ в мозгу животного вданных условиях опыта равно 0,25 ++ 0,04. Ошибка Формулы составляет5,2 Х,формула изобретения 1, Способ определения аденозинмонофосфата в ткани мозга путем исследования мгновенно замороженной ткани, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью упрощения способа эа счет сокращения числа стадий при комплексном определении аденеиловых нуклеотидов, в ткани мозга измеряют содержание концентрации аденозинтрифосфата, а концентрацию аденоэинмонофосфата определяют по Формуле: где у - концентрация аденозинмонофосфата,х - концентрация аденозинтрифосфата;У- постоянные величины.22, Способ по п,1, о т л и ч а ю - щ и й с я тем, что, с целью определения аденозинмонофосфата в мозге в условиях гипоксии, дополнительно измеряют время пребывания животного в условиях гипоксии и по содержанию аденозинтрифосфата с учетом времени пребывания в условиях гипоксии определяют концентрацию аденоэинмонофосфата,