Способ получения стрептокиназы

СОЮЗ СО 8 ЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУЬЛИК 4(5) С 12 И /70 ИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕН ГОСУДМРСТЭЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР 00 ДЕЛАМ ИЭОЬРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИ АвЮРСКОМУ СВИДЕ(56) 1 . Авторское свидетельство СССР1 625414, кл, С 12 Я 9/70, 1978,2. Авторское свидетельство СССРВ 944337, кл. С 12 Ч 9/70, 19823. Авторское свидетельство СССР(54) (57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СТРЕПТОВИНАф путем периодического культивирования продуцента - стрептококка группы "С" в присутствии глюкозы и бикарбоната калия с последующая отделениемкультуральной )кидкости и двукратныморидением целевого продукта этано-.лом сначала при рН 6,3 - 6,9 и затем,в изозлектрической точке, о т л ич а ю щ и й с я тем, что, с целью уменьшения расхода пищевого сырья и сниаения себестоимости целевого продукта, в качестве прадуцента используют щтамм Яйгерососсцз еВЫвьпи 11 з 92 1/18-77, продуцент культивируют на питательной среде, в кото" рую дополнительно вводят гидролизат каэеина с содеряанием аминного азота 90-220 мг Х, а такае двузаиещенный фосфорнокислый натрий и сернокислый магний при следующем соотноаении компонентов, мас.Х:Глюкоза 0,4-0,9 Двузамещенный фосфорнокислый натрий 0,1-0,4 Сернокиалый магний 0,01-0,02 Бикарбонат калия 1,01,2 Гидролизат казенкас содераанием аминного азота 90-220 мг Х Остальное 2. Способ по п, 1, о т л и ч а ющ и й с я тем, что после осаадения концентрат фермента подвергают диали зу против фосфатного буферного раствора и сорбционной очистке на фосфате кальция.Изобретение относится к технологии получения микробных ферментов и может быть использовано для получения препаратов стрептокиназы медицинского и вереринарного назначения. 5Цель изобретения - уменьшение расхода пищевого сырья и снижение себестоимости целевого продукта.Цель достигается тем, что соглас 10 но способу получения стретокиназы в качестве продуцента используют штамм ЗСгерсососсцз ерц 1 вашь 1 в 921/18-77, продуцент культивируют на питательной средев которую дополнительно вводят гидролиэат казеи 15 на, с содержанием аминного азота 90- , 220 мг 7., а также двузамещенный фос, форнокислый натрий и сериокислый натрий при соотношении компонентов, мас.7:20Глюкоза 0,4-0,9Двузамещенныйфорсфорнокислыйнатрий 0,1-0,4Сернокислый магний 0,01-0,02Бикарбонат калия 1,0-1,2Гидролизат казеинас содержанием аминного азота90-220 мг 7. Остальное 30После осаждения концентрат фермента подвергают диализу против фосфатного буферного раствора и сорбционной очистке на фосфате кальция.Н р и м е р 1. Производственный 35 штамм 8 сгерсососсцв едызаШв921/18-77 засевают на агар с 5 вес. й крови барана и помещают в термостат при 36 С на 18 ч. Затем, не допускаяоохлаждения культуры, ее смывают 40с агара казенновым бульоном и полученную взвесь выдерживают при той же температуре в течение 6 ч, пригоговляя таким образом посевной мате.риал. 45Казеиновую питательную среду для смыва и культивирования продуцентастрептокиназы готовят из панкреотического гидропизата каэеина, содержащего 800 мг 3 аминного азота. Этот 50 гидролизат разводят, внося в 371 лапирогенной дистиллированной воды89 л гидролиэата, после чего кипятят в течение 15 мин, фильтруют через асбесто-целлюлозные пластины 55 типа ФСи стерилизуют при 116 С.в в течение 30 мин, После охлажденияодо 36 С в разведенный гидролизат добавляют при перемешиванин стерильные ингредиенты". глюкозу, двуэамещенный фосфорнокнслый натрий, сернокислый магний и бикарбонат калия до.получения среды следующего состава,мас,7:Глюкоза 0,5Бикарбонат калия 1,0Двуэамещенный фосфатнатрия 0,2Сульфат магния 0,01Гидролизат казеина,разведенный до содержания аминногоазота 142 мг Е ОстальноеПосевной материал в объеме 40 лвводят в ферментер с 500 л приготовленной питательной среды. Культивирование осуществляют под контролем рН,Стадию культивирования осуществляютв течение 5,5 ч. За это время рНснижается до 6,8.Культуральную жидкость освобождают от микробной массы центрифугированием при факторе разделения Р 4000Получают осветленную культуральнуюжидкость в объеме 520 л с активностьюстрептокиназы 11000 ед/мл и содержанием побочных ферментов (стрептолизина) 128 ед/мл.Концентрацию водородных ионовдоводят добавлением в осветленнуюкультуральную жидкость ледяной уксусной кислоты до рН. 6,5, после чегопроизводят осаждение стрептокиназыпри температуре -7 С этанолом из расочета. концентрации последнего в смеси42 об.й. Операцию первого осажденияпроводят в течение 5 ч. Затем отделяют осадок центрифугированием при факторе разделения Р 1500 и температуоре -5 С в течение 20 мин. Для извлечения стрептокииазы осадок растворяют в физиологическом растворе, забуференном до рН 7,8. При этом объемфизиологического раствора берут равным 26 л.Во время выполнения операции первого осаждения рН при введении этанола повышается до 6,9, а по истечении часа достигает ранее установленного уровня 6,5. Нерастворившееся в эабуференном физиологическом растворе компоненты отделяют центрифугированнем при Р 1500 в течение 20 мин при комнатной температуреДалее производят второе осаждение стрептокиназы при рН 4,9 (т,е, в-изо- электрической точке) и следующих режимных параметрах: количество этанола в смеси - 43 об. %; температура осаждения - минус 1 С; время осажодения - 2,5 ч. Образовавшийся осадок отделяютцентрифугированием при Г 1500 и температуре -5 С в течениео20 мин. Для извлечения стрептокиназы 1 О осадок растворяют в 1,8 л 0,0158 М Фосфатного буферного раствора. Не- растворившиеся компоненты удаляют.После выполнения данной операции получают 1,8 л концентрата, активность стрептокинаэы в котором равна 241000 ед/мп, а стрептолизина - 5 12 ед/мл. Следовательно, выход стрептокиназы после второго осаждения составляет 20241000 х 18 х 1 ОЗ11000 х 520 х 10Концентрат вносят в целлофановые мешки (3 мешка по 600 мл) и диализуют в них против 100-кратного объе ма 0,0158 М фосфатного буферного раствора в течение 3-х суток приотемпературе 612 С. В результате диалиэа стандартиэируется солевой сос 1 тав концентрата и происходит освобождение от оставшихся солей питательной среды,Концентрат очищают от стрептолизина и пигментирующих веществ сорбцией нй фосфате кальция. Для проведения Э 5 операции сорбции предварительно готовят гель фосфата кальция путем смешивания 450 мл 0,5 М фосфатного буфера (рН 7,2) с 225 мл 1 М раствора уксуснокислого кальция с последующей 40 трехкратной отмывкой геля фосфата кальция 0,05 М Фосфатным буфером (рН 7,2). На образовавшийся гель наносят 1,8 л концентрата стрептокиназы и перемешивают в течение 20 мин 45 при комнатной температуре. После этого ферментный раствор отделяют центрифугированием в течение 20 мин при Р 1500.В результате получают концентрат 50 стрептокиназы в объеме 1,8 л с активностью 125000 ед/мл, свободный от стрептолизина и пигментирующих веществ.Выход стрептокиназы после сорбци .ониой очистки составляет125000 х 1 Зх 101,000 520 1 р х 100%=3,9%. П р и м е р 2. Производственный штамм БсгерСососсиз е 8 цдэ 1 пп 1 з 921/8-77 засевают на агар с 5 вес.% крови барана и помещают в термостат при температуре 37 С на 20 ч, Затем,оне допуская охлаждения культуры, ее смывают с агара казенновым бульоном и полученную взвесь выдерживают при той же температуре в течение 6 ч, приготовляя таким образом посевной материал.Казеиновую питательную средудля смыва и культивирования продуцента стректокинаэы готовят из панкреатического гидролизата казеина, содержащего 900 мг % аминного азота. Этот гидролизат разводят, внося в 100 л апирогенной дистиллированной воды 10,3 л гидролизата, после чего кипятят в течение 15 мин, фильтруют через асбесто-целлюлозные пластины типа ФСи стерилизуют при 116 Со в течение 30 мин. После охлажденияодо 37 С в разведенный гидролизат казеина добавляют при перемешивании стерильные ингредиенты: глюкозу, двузамещенный фосфорнокислый натрий, сернокислый магний и бикарбонат калия до получения среды следующего состава, мас.%:Глюкоза 0,9.Двузамещенный фосфатнатрия 0,3Сульфат магния 0,015Бикарбонат калия 1,2Гидролизат каэеина досодержания аминногоазота 103 мг% ОстальноеПриготовленный посевной материал в объеме 8 л,вводят в ферментер с 112 л вьппеуказанной питательной среды, Операцию культивирования продуцента осуществляют при 36 С в течение 5 ч в периодическом режиме под контролем рН, При этом, начиная со 2-го часа культивирования, осуществляют импульсное перемешивание микробной взвеси, За время культивирования происходит снижение рН до 6,3.Культуральную жидкость осветляют центрифугированием при факторе разделения Г 4500, после чего производят фильтрование ее сначала через асбестовую пластину Ф-ЗОО, а затем через миллипоровую мембрану с размером пор 0,22 мкм. Получают фермент- содержащий раствор с активностьюТаблица 1 трептониназа,ед/мл 1760 Выходные параметры Режимные параметры М 880 вес.7. Кислот- Оптнчеслюкаа,ес.Ж ность, кая плотед. рН ность 1 80 07 04 2 . 150 05 02 0,017 8,1 0,010 7,8 0,16 040 10000 3 150 0,5 0,2 0,010 7,3 6390114774 стрептокиназы 7520 ед/мл, стрептоли-. назы - 128 ед/мл в объеме 110 л.Концентрацию водородных ионов в ферментном растворе доводят добавлением ледяной уксусной кислоты 5 до 6,3, после чего производят первое осаждение стрептокииазы обработкой данного раствора 40 об,7 этанола при температуре -8 С в течение 4 ч, При введении этанола до вышеуказанной 16 концентрации его в смеси рй.повышается до 6,7, а но истечении часа достигает 6,4. Затем отделяют осадок центрифугированием смеси в течение 20 мин при Р 1500 и температуре -5 С. 15 Для извлечения стрептокиназы осадок растворяют в 5 л 0,0158 И фосфатного буферного раствора, Нерастворившиеся компоненты удаляют.Далее производят второе осаждение 20 стрвптокиназы при рН 4,9, т.е. в изозлектрической точке, при следующих режимных параметрах: количество зтанола в смеси - 40 об.Х; температура -10 Сф длигельность второго осажде ния - 3 ч. Образовавшийся осадок отделяют цеитрифугированием при Р 1500 и температуре -5 С в течение 20 мин. Для извлечения стрептокиназы осадок растворяют в 0,4 л 0,0158 М ЗО ,Фосфатного буферного раствора. Не- растворившиеся компоненты удаляют.После выполнения данной операции получают 0,4 л концентрата с актив,ностью стрептокниазы 430000 ед/мл; а стрептолнзинв - 512 ед/мл. Поэтому выход стрептокиназы после 2-го осаждения равен--- а - х 100 йф 20, 8 Ж .4300 ООхО 4 х 10 ф7526 х 1 10 х Ю 40,цщцентрат вносят В целлофановый ;мешок н диализуют против 40 л 0,0156 И фосфатного буферного раствора в течение 3-х суток при температуре 6+2 С,Для проведения операции сорбционной очистки предварительно готовятгель фосфата кальция путем смешивания 100 мл 0,5 М фосфатного буфера(рН 7,2) с 50 мл 1 М раствора уксуснокислого кальция с последующейтрехкратной отмывкой геля фосфатакальция 0,05 М фосфатным буфером(рН 7,2). На образовавшийся гельфосфата кальция наносят 0,4 л концентрата стрептокиназы и перемешиваютв течение 20 мин при комнатной температуре, После этого ферментный раствор отделяют центрифугированиемв течение 20 мин при Г 1500.В результате получают концентратстрептокиназы в объеме 0,4 л с активностью 196500 ед/мл, свободныйот стрептолизина и пигментирующихвеществ.Выход стрептэкиназы после сорбционной очистки составляет500 х 04 х7520 х 110 х 10фВ табл. 1 показано культивирование Бйгерсососсиз еяжсивЫв921/18-77 в казеиновой питательнойсреде при различных режимных параметрах.В табл. 2 представлен выход стрептониназы по стадиям технологическогопроцесса.Для установления оптимального режима получения стрептокиназы принимают во внимание не только количество фермента, накопленное на стадиикультивирования, но учитывают такжепотери целевого продукта на последующих стадиях технологического процес.са, которые, как представлено в табл.2зависят от условий культивирования,114 7 49 Продлжение табл.1 Выходные параметры Режимные параметры Кислот- Оптнчестрептонинаэад/мп но кая н ст от Ф6 00 0,7 0,33 90 0,6 0,4 0 8 40 ица Режим, Выход стрептокиназы в ее содержаниюв бульонной культуре осажде П осаждени,6 7,Составитель Е.Воробьеваедактор В.Ковтун ТехредМ.Гергель Корректор Н.Король Тираж 525 Государственнбго ко о делам изобретений ква, Ж, Раушская 1500/25ВНИИПИ 5, Мос иал ППИ "Патент", г.ужгород, ул.Проектна Фрезяма, Я 40 06 01 40 06 03 0,35 0,28 0,40 Подписное тета СССР открытий аб., д. 4