Способ количественного определения коллагена

В,М. Земсков, М.Д, Смирнов, А.Б. Алексеев и,Ц,.,П. Масейко 2) Авторы изобретеии ентр АЙЯ СССР-="-Ък,) Заявитель кардиологический научный сесою 54) СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОЛЛАГЕНА е,Изобретение относится к медицина именно иммунологии, и может быть использовано при анализе иммунных препаратов.Известен способ количественного. определения коллагена радиоиммунологическим методом, заключающийся в том, что к исследуемому образцу добавляют известное количество меченно го радиоактивным изотопом коллагена и определенное количество антител (АТ) или антисыворотки к этому коллагену. Образовавшиеся в ходе имму" нологической реакции нерастворимые комплексы антиген-антитело (АГ-АТ) отделяют соосаждением с дополнительной, не связанной с исследуемой системой АГ-АТ, дающей обильный преципитат. После тщательной отмывки осадка от неспецифически сорбировавшегося меченного коллагена по преципитировавшей радиоактивности, с помощью заранее построенной калибровочной кривой, определяют количество коллагена в исследуемом растворе.Чем больше коллагена в исследуемомрастворе, тем меньшая часть от внесенного меченного коллагена осядет ввиде преципитата, так как между коллагеном исследуемого раствора ивнесенным меченным коллагеном происходит конкуренция за антитела кколлагену 113.Основным недостатком этого метода является сложность методическихпроцедур, трудоемкость и многоэтапность его проведения, Процесс маркирования радиоактивными метками связан с исрользованием больших коли Зчеств изотопов. Необходимость проведения маркирования антигена сопровождается частичной денатурацией молекулы и нарушением ее антигенных 20свойств. При этом равная конкурентнаяспособность меченного и немеченногоколлагенов в реакции с антителамине всегда имеет место, что сказывает.ся на результатах анализа. Кроме то 3 9357 го, при отмывании преципитата возможно его частичное растворение, что также влияет на точность измерения.Цель изобретения - упрощение способа количественного определения кол ла гена.Поставленная цель достигается тем, что согласно способу количественного определения коллагена, включающему постановку серологической реакции с исследуемым раствором и последую-. щее измерение преципитирующей радиоактивности, предварительно проводят адсорбцию коллагена на полихлорвиниловую поверхность в буферном растворе 1 при рН 9,0- 10,0 и температуре 30- 375 вС в течение 2-6 ч, затем на полихлорвиниловую поверхность наносят разведения исследуемого раствора с фиксированным количеством антител к колла-гену инкубируют при 16-25 С в течение 3-4 ч и связывающиеся при этом антитела детектируют "вторыми" ф 1-анти- телами к иммуноглобулину животногопродуоента антител к коллагену.П р и м е р 1. Исследуемый образец в различных разведениях смешивают с определенным количеством антител (антисыворотки) к коллагену, При этом часть внесенных антител связывается с коллагеном, содержащимся в исследуемом образце и теряет способность в дальнейшем взаимодействовать с колла- геном, После непродолжительной инкубации в течение 1-2 ч при комнатной : температуре полученный раствор вносят в лунку полихлорвиниловой поверхности, на которую адсорбирован коллаген, Коллаген в буферном растворе рН 9,0-10,0 адсорбируют на полихлорвиниловую по-. верхность в течение 2-6 ч при темпеао ратуре 30-37,5 ОС. Антитела, не провзаимодействовавшие с коллагеном исследуемого образца, специфически реагируют с коллагеном, абсорбированном на твердой поверхности. После этоговсе неспецифически адсорбированные вещества удаляются промыванием, а антитела, связавшиеся с коллагеном твердой Фазы остаются и затем детектируются "вторыми" меченными 1 Э-ан- О тителами к иммуноглобулинам животного - продуцента антител к коллагену. Избыток "вторых" антител удаляют промыванием. Количество коллагена определяется по калибровочной кривой (см, чертеж), исходя иэ количества радиоактивности, специфически связавшейся на полихлорвиниловой поверх 92 фности. Построение калибровочной кривой отличается тем, что в качестве исследуемого берут препарат чистого коллагена известной концентрации.П р и м е р 2.,А. Получение твердой фазы.В лунку полихлорвиниловой поверхности вносят 50 мкл раствора коллагена 1 типа быка (17 мкг/мл) в 0,01 М натрий-карбонатном буфере рН 9,6 и ингибируют 2 ч при 37 ОС и ночь при 4 С. Промывают 1 О раз холодной водоопроводной водой и вносят в каждую лунку по 200 мкл 104-ной нормальной лошадиной сыворотки в фосфатном буфере рН 7,0 (0,15 М К НРО+ 0,075 М ИаС + 0,02 а Май а + 0,5 а детергената). После инкубации в течение 2 ч при комнатной температуре 5 раз промывают 14-ной нормальной лашадиной сывороткой и хранят при +4 ОС до использо.- вания (2-3 ч)Б, Определение количества коллагена в образце.К 50 мкл сыворотки, содержащей ант титела кролика к коллагену 1 типа быка, добавляют по 50 мкл различных разведений исследуемого образца,сделанных на Фосфатном буфере рН 7;0 (О, 15 М КНРО,+ 0,075 М йаС 1, рН 7,0) и инкубируют 2 ч при комнатной температуре. Затем этот раствор вносят в пэдготовленные, как описано по примеру 2 А, лунки полихлорвиниловой поверхности, покрытие коллагеном, и инкубируют 3-4 ч при комнатной температуре. Промывают проточной водой и вносят по 50 мл раствора "вторых", меченных (Б 1) антител барана к иммуноглобулину кролика (,50 х 10 имп/мин, в фосфатном буфере рН 7,0). Инкубируют ночь при 4 ОС, промывают протбчной водой, вырезают лунки и просчитывают радиоактивность на гамма-счетчике, Для неразведенного исследуемого образца получают счет 24250 имп/мин, При разведении этого же образца в 1 О раз получают счет равный 39350 имп/мин. Исходя из внесенного количества радиоактивности 50000 имп/мин вычисляют процент подавления связывания радиоактивной метки с твердой фазой, равным 51,5 и 21,3 соответственно. Количество коллагена 1 типа быка в исследуемом растворе определяют по калибровочной кривой (см, чертеж), исходя из процента подавления связывания радиоактивной метки, учитывая разведение. Используя данные, полу935792 Формула изобретения Способ количественного определения коллагена, включающий постановку серо логической реакции с исследуемым раствором и последующее измерение пре. ципитирующей радиоактивности, о т л ич а ю щ и й с я тем, что, с целью упрощения способа, предварительно про. водят адсорбцию коллагена на поли- хлорвиниловую поверхность в буферном растворе при рН 9,0- 10,0 и температуре 30-37,5 С в течение 2-6 ч, затем на полихлорвиниловую поверхность наносят, разведения исследуемого раствора с фиксированным количеством антител к коллагену, инкубируют при 16-29 С в течение 3-4 ч и связавшиеся при этом антитела детектируют "вторыми" фЧ -антителами к иммуноглобулину животного -, продуцента антител к колла- гену. ченные при разведении исследуемого раствора в 10 раз, находим, что в 50 мкл этого разведения содержитсяО, 11 мкг коллагена или его концентра. ции 2,2 мкг/мл. Используя данные для .неразведенного образца, получают,чтов 50 мкл исследуемого раствора содер жится 0,10 мг коллагена или его концентрация составляет 2,0 мкг/мл,Усредняя полученные величины находят, 16 что в исследуемом образце концентрация коллагена 2,1 мкг/мл.П р и м е р 3. Условия проведения опытов аналогичны примеру 1, за исключением того, что в качестве иссле з дуемого образца берут раствор коллагена 1 типа быка с исходной концентрацией 1 мг/мл. Делают разведения исследуемого образца в 100 и 10000раз. Количество связавшейся радиоак- щтивности оказалось равным 22130 имп/мин и 43550 имп/мин соответственно, а процент подавления связывания составляет 55,8 и 13,03 соответственно.Определенная по калибровочной кривой кон- Ю центрация исходного раствора. составляет 0,93 мг/мл и 1,05 мг/мл соответственно.Из полученных данных видно, что способ позволяет получить результат зф с точностью 63, что вполне удовлетворяет требованиям, предъявляемым к подобным методам в биохимии и сравнима с известным жидкостным методом определения количества коллагена. В то же время предложенный способ методически значительно проще, чем жидкостной.Предложенный метод определения коллагена 1 типа является высокочувствительным, точным, воспроизводимым, высокоспецифичным, технически удобным, высокопроизводительным и не тре. бует работы с большими количествами радиоактивности, Чувствительность ме тода 1 нг коллагена в пробе 50 мкл или 20 нг/мл. Специфическое связыва-, ние "вторых" АТ составляет 30-40 вносимой. дозы, а неспецифическое 0,9- 4,5 В ЬПредлагаемый способ позволяет абсолютно специфично количественно определять коллаген в физиологических растворах. В связи с этим этот способ найдет самое широкое применение не только в лабораторных исследованиях, но и в клинической практике, благодаря своей простоте и вы"оким технико- эксплуатационным показателям, Использование малых количеств радиоактивности делает этот метод практически полностью безопасным, не требуя также никакого вспомогательного сложного оборудования, Полностью подготовленные для определения радиоактивности пробы могут храниться неделю в любых условиях, а при использовании пересчета на распад изотопа - практически неограниченно долго. Источники информации,принятые во внимание при экспертизе1. Иепге 1 1. Кад 1 о 1 паопоаьзауГог апс 1 со 11 адеп ап 11 Ьод 1 ея цз 1 пцфС;1 аЬе 11 ед со 11 адел. 3 1 щвцпо 1 .МейЬ,1977 15 . р 77-95935792 ф Ъ 5 аинигу карпа ку 10 ставитель О.Петрачевахред И. Гайду актор М. Петрова орректор Н. Сте Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул, Проектная ф-ЫОуфви ъ щ аказ 4198/44 Тираж 887 ВНИИПИ Государственного по делам изобретений и 113035, Москва, Ж, Ра