Способ индикации васillus cereus

ОП ИСАНИЕИЗОБРЕТЕН ИЯК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ Сооз Советски кСоцнапистнчесннкРеспублик) 29 Э 6994/28 -лено 13.05,80 ( С 12 й 1/00/ //С 12 М 1/00, С 12 й 1/085 нсоединением заявк дарстюиы канате СССР делам изобретений и открыли) УДК 576.8. ,09 З, (088.8) Дата опубликования сания 15.0 М, Суворков 4 2) Авторы изобретен И. Кудрявцев, , М. Москвина А. Куэн Всесоюзный научно-исследовательский институт биологического приборостроения 7) Заявител ДИКАЦИИ ВАО. ОЯ СЕВЕО 54) СП Изобретение относиа именно к способамроорганиэма по реакции к микробиологии,ределения вида микиммунофлуоресцен.чениепери- ентриется тем, что соглас Васца сегепа в су ен пособу индик Известен способ индикации Васца сегеца в суспензии, содержащей смешанную микрофлору, путем добавления к суспензии микроорганизмов люминесцирующих антител, отмывания от несвязавшихся ыггител с последую. щим возбуждением суспензии светом и опре.делением интенсивности свечения 1Однако при снятии спектра, близкое расположение пике светорассеяния, при некотором превышении концентрации примесных микро. организмов в пробе. над спецнфичныьи, приводит к наложению пика светорассеяния на пик люминесценции, что не позволяет достоверно определить наличие искомых мнк. роорганизмов в присутствии примеси, и снижает чувствительность способа.Цель изобретения - повышение точности способа.Эта цель достнга но зии, содержащей смешанную микрофлору,путем добавления к суспенэии микроорганиз.мов люминеспнрующих антител, отмыванияот несвязавшихся антител с последующимвозбуждением суспензия светом и определением интенсивности свечения, суспензию возбуждают при 365 нм, дополнительно регистрн.руют интенсивность светорассеяния суспензиив начале пика люминесценции и наличиемикроорганизма определяют по отношениюинтенсивности люминесценции в максимумепика к. интенсивности светорассеяния,П р и м е р. Берут суспензию микроорганизмов культуры ВасИоа сегецв в кон.центрации 2 10 т кл/мл в количестве 4 мл,В реактор с клетками прибавляют 1 млраствора антител (меченых флуоресцеиниэотиоцианатом) для получения концентрацииантител по белку равной 1 - 2 мг на 1 суспензия. Суснензию инкубируют в те 10 - 15 мни при комнатной температуре, одически встряхивая. Затем суспензию ц футируют 15 мин при 8000 об/мин. Надосадочную жидкость отбрасывают. Осадок окра.шенных микроорганизмов два раза отмывают от несвязавшихся антител 5 мл физиологического раствора, цептрифугируя, как описано выше. Отмытые клетки суспендируют (перемешиврн) в новой порции физиологи. ческого раствора и переносят в флуоримет. рическую кювету, Суспензшо возбуждают светом в более коротковолновой области, а именно в области 365 нм. Снятие спектра эмиссии проводят на сканирующем приборе МРЗ - 5000, позволяющем записать спектр в области от 460 до 600 нм на самописце,Затем измеряют в относительных единицах интенсивность люминесценции в области 530 нм (максимум пика) и интенсивность светорассеяния в области начала пика люминесценции 480 нм. Определяют отношение интенсивности люминесценции к интенсивностисветорассеяния,Результаты индикации Вас 11 Ья сеген приве.дены в т абл 1Интенсивность излучения суспензии Вас 111 из"сегецз в концентрации 1 10 клеток в 1 млв исследуемых областях 0,70 и 0,58, а отношение 0,83, Интенсивность излучения суспензии Вас 111 цв сегецз в .концентрации 2 10,обработанной люминесцирующими аитителамй,0,01 и 0,42, а отношение 42. Таким образом,неокрашенная суспензия в концентрации1 10 показывает интенсивность в области530 нм 0,58, тогда как суспензия 2 10 ,окрашенная антитепами, дала величину 0,42,т.е. меньптую по абсолютной величине, Введе.ние величины :;веторассеяния в оц-,.": содержания микроорганизмов и испбльзованиеотношения люминесценции к светорассеяшпопозволяет получить значительное превышениеотношения окрашенной культуры к неокрашенной.Примесные микроорганизмы, в качестве46которых использована культура ЕзсЬегВ 1 асо 11 в концентрашщ 1 109 кл/мл, обработанные люмннесцирующими антителами и двухкратно огмьпые физиологическим раствором,показывают интенсивности 0,14 и 0,14, аотношение 1,0. Отношение окрашенных искомых микроорганизмов в 40 раэ превышаетотношение обработанных примесных микроорганизмов, тогда как интенсивность искомых,в области 530 нм превышает интенсивностьпримесных в этой области только в 3 раза.Добавление примесньтх микроорганизмовв концентрации, в 50 и 500 раз превышаю 8 4щей искомые (1 10 и 1 10"), дает стношение 5,4 и 3,2.Таким образом, отношение смеси превышает отношение обработанных и отмытыхпримесных клеток приблизительно в 5 и 3раза и свидетельствует. о наличии в пробеискомых микроорганизмов,При более низких концентрациях антителможно достоверно определить наличие иско.мых микроорганизмов в пробе,В табл, 2 представлены результаты инди.кации Вас 111 ца сегежка дпя малых концентраций суспензии.Искомые микроорганизмы в концентрации2 10 кл/мл смешивают с примесными в концентрациях 5 10, 1 10" и 5 10 кл/мл, а также, берут отдельно искомые 2 10 кл/мл и примесные 5 10 кл/мл, Люминесцируюшче антитела берут в концентрации 1,4 мг/мл, Суспензии с 25, 50 и 250 кратным превыше.вием примеси над искомыми микроорганизмами дают приблизительно одинаковые интен.сивности в области 530 нм, однако некоторое изменение в начале пика люминесценции приводит к изменению отношения, которое сни.жается с увеличением примеси и составляет: 7, б,б и 5,0 при 24,0 в чистой культуре.Эти же пробы, но без обработки люминесцирующими антителами, дают интенсивность в области начала пика люминесценции: 0,2, 0,2 и 0,72, а отношения меньше 1,0.Эти данные показывают, что у всех необга ботанных люминесцирующи 141 антитслами суспензий интенсивность светорассеяния выше, чем у обработанных. Из этого следует, что отношение исследуемых интенсивностей в при. сутствии примеси снижается,. однако примесь не маскирует присутствие искомых микро организмов в пробе, и эта закономерность сохраняется при низких концентрациях иско. мого микроорганизма в пробе.Предлагаемыйспособ позволяет точно определить вид микрооргатщэма в объеме про. бы на фоне примеси в промьппленньтх условиях и в санитарно защитной зоне предприятий микробиологической промышленности, где незначительно превышение примесных над искомьтьвя микроорганизмами, Способ с успехом может быть использован для стандартизации и оценки качества люминесцирующих антител, изготавливаемых в производстве,905278 звание мнкроорганнзазв кловизе 8 0,83 т О 2,0,4 2 О,27 егЬ 16 со Т а сеязазясвете от. 6 ДИНИЦЫ 7,0 ВасИ 10 в ЕвсЬег 1 Ь гецв со 1 106 0,03 10 Гецз соИ есзИОввсЬегЬ 1 2 106 0,2,09 1 Ов 1 О 6 СИцв се всЬепЬа со 1 2 106 0 0,20 асИ 10 сеГ 6 0 ЕвсЬег 1 Ь 16 Вас Ицв сегецв Вас 111 цв сегецв сИ 1 цв сегецвсЬегЬ 16 со ВасИОв сегецв ЕвсЬегЬа со 11 ЕвсЬегЬ 16 со Название микроорга- низма ВасИ 106 сеГ 60ЕвсЬег 1 Ь 16 со всЬегзЬза со 1 з КонцентрацияВасОв саге.ОВ, КЛ/МЛИСКОМЫ 6 КащентрацияЕвсЬегЬ 16со 11 кл/млпримесные КонцентрацияЛЗЕМНН 6 СЦИруаицнзз аи.тител, мг/мл КонцентрацияЛЮМННССЦИруенцих аитител мг/мл Таблица 1 1,0, 693 ОтношениелзОмюзесзтеищзи к смто рессеяннзе7 905278 8Формула изобретения сивность светорассеяния суспензии в началепика люминесценции и наличие микроорганиэ.Способ индикаций Васца сегеиа в суспен ма определяют по отношению интенсивности зии, содержащей смешанную микрофлору, люминесценции в максимуме пика к интел. путем добавЛения к суспензии микроорганиз. 5 сивности светорассеяния.мов люминесцирующих антител, отмывания Источники информации, от несвязавшихся антител с носледуюшим принятые во внимание при экспертизе возбуждением суспензии светом и определе. Рубан С. 3. Использование прямой флуо нием интенсивности свечения, о т л и ч а- риметра для количественной оценки в люю щ и Й с я тем, чтос целью повышения 10 минесцентосерологическом методе индикации точности способа, суспензию возбуждают при микроорганизмов. Автореф. дис. на соиск.365 нм, дополнительно регистрируют интен- учен, степени канд. биол, наук, М., 1974,Составитель С. МалютинаТехред Э.Вереш Корректор Г ШомакРедактор Н. КиштулинецЗаказ 29 /37Тираж 504 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий13035, Москва, Ж - 35, Раушская наб., д, 4/5Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4