Способ определения интенсивности дыхания микроорганизмов

Союз СоветскихСоциалистическихРеспублик ОПИСАНИЕИЗОБРЕТЕНИЯК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ оц 958495(22) Заявлено 23. 02. 81 (21) 3247656/28-13с присоединением заявки Ио 1 М К,1 з С 12 Б 1/00 Государственный комитет СССР по делам изобретений и открытийОпубликовано 150982. Бюллетень,М 9 34 Дата опубликования описания 15.09,82(72) Авторы изобретения Н.С. Паников, Т.ф. Бондаренко и Д.Г. Звягин В("СОР" т т Московский ордена Ленина, ордена ОКтябрьской и ордена Трудового Красного Знамени государ университет им. М,В. Ломоносова(71) Заявитель 54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ИНТЕНСИВНОСТИ ДЫХАНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВтенамлек 20 Изобретение относится к общей и технической микробиологии и может быть использовано для изучения кинетических параметров роста микробных культур, 1 три контроле процессов ферментации и т.д.Известен способ определения ин сивности дыхания микроорганизмов перометрически с использованием э трода Кларка 1)Недостатком известного способа является то, что он,дает заниженные величины скорости дыхания, так как в процессе отбора пробы и ее переноса в полярографическую ячейку значительная часть субстратов дыхания успевает потребиться,Наиболее близким к предлагаемому по технической сущности и достигаемому эФфекту является способ определения интенсивности дыхания миКроорганизмов, предусматривающий непрерыв. ное культивирование их в аэробных условиях с последующим расчетом. Согласно этому способу измерение потребления кислорода микроорганизмами производится непосредственно в ферментере путем анализа стационарных концентраций О и СО в составе поступающей и выходящей из ферментера газовой смеси с пооледующим расчетом потребления О или выделения СО по разности 2.Данный способ характеризуется необходимостью поддержания скорости подачи воздуха в ферментере на строго определенном уровне, использованием дорогостоящих приборов - газоанализаторов, а также низкой чувствительностью и надежностью определения.скорости потребления кислорода, вследствие чего данный метод позволяет получать воспроизводимые результаты лишь при измерении интенсивности дыхания плотных и быстро растущих культур.Целью изобретения является повышение точности и чувствительности способа.Поставленная цель достигается тем, что согласно способу определения интенсивности дыхания микроорганизмов, предусматривающему непрерывное культивирование их в аэробных условиях с последующим расчетом, предложено в процессе непрерывного культивирования изолирование микроорганизмов от аэрирующего воздуха, измерение потребления растворенного в культуральной среде кислорода амперометричес958495 где Со и С - концентрация растворенного кислорода в подаваемой среде (верхний предел насыщения кислородом нрн данной температуре) и микробной культуре соответственно, мкА/л; К,- коэффициент массопереноса кислорода, ч "; х - биомасса микроорганизмов, мг/л; с 1 - удельная скорость потребления кислорода( - . - мкА/чмг. 45оахСтационарные величины концентрации С могут быть найдены из уравнения (1) при условии Йс(ЙФ = О 50 культуру через нижнюю часть ферментационного сосуда. Постоянство объемакультуры поддерживается за счет удаления избытка микробной суспензии стоком воздуха через вертикальнуюсливную трубку 2, вмонтированную впробку из нетоксичной резины 3, срезанную под углом к горизонтальнойплоскости. В эту же пробку вмонтированы датчик растворенного кислорода со Хо(3) а, - =-с) х а, о,ки, возобновление подачи воздуха ирегистрация возрастания концентрациирастворенного кислорода, а при расчете интенсивности дыханий проведение коррекции калибровки датчикарастворенного кислорода по формуле Хо Кгде С и С - соответственно конценотрации растворенногокислорода в подаваемойсреде (верхний пределнасыщения кислородом приданной температуре) и )5микробной культуре,мкА/л;К - коэффициент массоперенобса кислорода, ч-;Х - биоМасса микроорганизмов, мг/л;20- удельная скорость потребления кислорода,мкА/ч мг.Сущность предлагаемого способа заключается в следующем.Скорость измерения концентрациирастворенного кислорода (С) в непрерывной хемостатной культуре микроорганизмов определяется соотношениемпроцессов его транспорта из газовойфазы в жидкую и потребления микробной биомассой в ходе дыхания,="о(Со ) ФО Х, (1) 0 После отключения подачи воздуха в культиватор массообмвн между газом и жидкостью пРекРащаетсЯ т.е. Кьд(С - 55 С)=0, и тогда скорость дыхания микробной культурых) количественнооаопределяется по скорости падения концентрации растворенного кислорода Возобновление подачи воздуха вкультиватор приводит к увеличению ссо скоростью; которая может быть рассчитана путем интегрирования уравнения (1) при граничных условиях г, = О,С =С,иС-С=-К С, (4)С- ,вгдв С;, - концентрация растворенного кислорода в момент возобновления аэрации.Уравнение (4) дает возможность графоаналитического определения коэффициента массопереноса К 1 в координатах , - в . - т В, уравнении (4) вместо величины С правомерно использование любых физических величин, линейно связанных, в том числе величина напряжения растворенного кислорода Я или" электрического тока в полярографическом зонде, используемом для экспериментальйого определения Р В связи с этим калибровку полярографического зонда оказывается возможным производить непосредственно в ходВ выращивания культуры, сопоставляявеличины силы тока со значением С,рассчитанным по уравнению (2). Величину С при этом находят из температурной зависимости растворимости кислорода в воде а Кь и скорость дыхания с 1 х измеряют экспериментально.На фиг. 1 схематично изображена установка для культивирования; на фиг. 2 - электрод Кларка; на фиг.З изменение концентрации кислорода.Дрожжевую культуру БеЬаг 1 огпусез йопп 1 саг 1 цз ВКМ-Увыращивают при 28 ОС на синтетической среде следующего состава, г/л; глюкоза 0,2; (ИН 4) 804. 0,4; МЯЯ Ф 7 Н О 0,1;СаС 1. х 2 Н О 0,021 КНРО 4 0,8 Р ЗДТА 0,005; биотин 0,00001 у смесь микроэлементов.Я.Культивирование ведут при скорости разбавления О:0,069 ч " в установке, изображенной схематично на фиг.1. Выращивание микробной культуры производят в стеклянном ферментационном сосуде 1 объемом 600 мп с рубашкой для термостатирующей жидкости. Перемешивание культуры осуществляют магнитной мешалкой, подачу среды - перистальтическим насосом. Увлажненный стерильный воздух поступает в 4, пробоотборник 5, используемый также для инокуляции, и толстостенныйкапилляр для ввода стерильной питательной среды 6. Описанная конструкция ферментационного сосуда позволяет быстро (1-2 с) изолировать культуру от атмосферного воздуха путем прекращения его подачи (перекрытие входа 7). Барботажный воздух выходит из ферментационного сосуда через отверстие в резиновой пробке с последующим установлением уровня жидкой фазы в пределах сливной трубки 2 (отмечено пунктиром).Для измерения концентрации (напряжения) растворенного кислорода используют жалоинврционный и выдерживающий стерилизацию автоклавирова нием модифицированный электрод Кларка, который состоит (фиг. 2) из двух стеклянных деталей - корпуса 8 и стержня 9, несущего платиновый катод 10 в торцовой части, и серебря ный анод 11 в виде пластины или спи,рально накрученной вокруг стержня проволоки. Стержень 9 пришлифован к нижней части корпуса датчика, что дает воэможность фиксировать катод в 20 строго определенном положении. Между пришлифованными поверхностями оставлен канал 12 (за счет того, что стержень имеет в поперечном сечении форму круга, усеченного по хорде), 25 наличие которого необходимо для продолжительной работы датчика. Нижнее отверстие корпуса 8 закрывают фгоропластовой мембраной 13 (Г, толщина 12 мкм), фиксирует ее кольцом из З 0 селиконовой резины 14 и эпоксидным клеем 15. Затем в корпус вводят электролит (1 н ИаС 1) и стержень 9 с электродами, укрепляя последний в верхней части корпуса резиновой прокладкой 16 и парафином, Окончательную сборку датчика (введение электролита и установку электродов) производят после автоклавирования (0,5 атм, 30 мин) корпуса 8 с мембраной 13 в составе полностью собранной установки для непрерывного культивирования микроорганизмов.После стабилизации культуры (3 сут, после инокуляции) производят измере,ние интенсивности дыхания; прекраща ют подачу воздуха в ферментатор и 1регистрируют концентрации растворенного кислорода (фиг. 3), затем возобновляют подачу воздуха и регистрируют возрастание концентрации раство ренного кислорода. Величину Кь рассчитывают .по уравнению (3)-13 ч ф; значение в по уравнению (2) оказывается равным 459 мкА О , и скорость дыхания культуры (по уравнению 3) - 55 344 О3 час Предлагаемый способ позволяет повысить надежность и чувствительность определения интенсивности дыхания микроорганизмов более чем в 20- 100 раз, по сравнению с известным способом, дает хорошо воспроизводимые результаты с относительной ошиб-. кой определения, не превышающей .2,формула изобретенияСпособ определения интенсивности дыхания микроорганизмов, предусматривающий непрерывное культивирование их в аэробных условиях с последующим расчетом, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения точности и чувствительности способа, в процессе непрерывного культивирования микроорганизмы изолируют от аэрирующе -го воздуха, измеряют потребленче растворенного в культуральной среде кислорода амперометрически, возобновляют подачу воздуха и регистрируют возрастание концентрации растворенного кислорода, ъ при расчете интенсивности дыхания проводят коррекцию калибровки датчика растворенного кислорода по формулеС Соььгде Сь и С - соответственно концентрации растворенногокислорода в подаваемойсреде (верхний пределнасьпрения кислородом приданной температуре) имикробной культуре,мкА/л;К - коэффициент массопереноЬьса кислорода, чК - биомасса микроорганизмов,мг/л;в, - удельная скорость потребления кислорода,мкА/ч мг.Источники информации,принятые во внимание при экспертизе1. Шольц К.ф., Островский Д.Н.Ячейка для амперометрического определения кислорода. В сб. Методысовременной биохимии, 1975, М.,Наукаф, с. 52-58,2, 0113 че И, Ко)с 1.1. Апа 1 уз 1 з ойдгожЬ ой 91 цсопоЬасгег охуйапз Ы91 цсозе сопг.а 1 п 1 пс( теЖа.АгсЬ.М 1 сгоЬ 1 о 1, 1979, 121,3, р. 283-290,ректор Н. К Тираж 505 ВНИИПИ Государственного коми по делам изобретений и отк 3035, Москва, Ж, Раушская