Способ хранения соrуnевастеriuм diрнтнеriае штамм pw-8 торонто

Союз СоввтскмхСоциалистическихРеспубпик ОП ИКАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ пц 905279по делам изобретений н открытий(54) СПОСОБ ХРАНЕНИЯ СОВУ 1 чЕВАСТЕВЮМ 01 РНТНЕВ 1 А 1.Е ШТАММ РЭТОРОНТО Изобретение относится к медицинской мик.робиологии и может быть использовано в практике бактериологических лабораторий.Известен способ длительного хранения, без периодических ересевов, штаммов различных видов микроорганизмов, в том числе коринебактерий дифтерий, путем их лиофильного высушивания в среде со стабилизатором. В качестве стабилизатора в среде для высуцптвания используют сыворотку крови, снятое молоко, 10%-ный водный раствор сахарозы, 10%-ный раствор сахарозы с 1% желатины 111.Однако как в процессе высушивания, так и при хранении, происходит значительное отмирание микробных клеток, с колебаниями15 в зависимости от среды высушивания и температуры хранения; При лиофилизацин в условиях вакуума имеется опасность загрязнения высушиваемых штаммов микроорганизмов в результате попадания в ампулу посто-.ронней микрофлоры из воздуха или из систе-. мы аппарата лиофильной сушки, а также опасность заражения персонала, при работе с лиофилнзированными штаммами патогенных микроорганизмов, больше, чем при работес жидкими микробными культурами, так какпри вскрытии ампул с концентрированнымпорошкообразным микробным материалом подвакуумом создается гораздо большая возможность распыления и аэрозольного заражения патогенными микробами.Известен также способ хранения Согупе.Ьастегшпз йрЬтЬег 1 ае штамм РЧЧТоронто путем посева в защитную среду с последующим инкубированием посева и хранением при 4 - 10 С .(21.Однако известный способ позволяет сохранить жизнеспособность коринебактерий диф. терни только до 3 мес., для многолетнего хранения штамма необходимы периодические пере севы,Цель изобретения - удлинение сроков хранения без периодических пересевов.Эта цать достигается тем, что согласно способу хранения СогупеЬастегшп 1 йрЬЬег 1 ае штамм РтУТоронто путем посева в защитную среду с последующим инкубированием посева и хранением при 4 - 10 С, штамм за3905279севают в культуру фибробластов человеческого эмбриона и инкубируют в течение четырехдней,Способ осуществляют следующим образом.В качестве среды для хранения коринебактерий дифтерии применяют однослойнуюпервично-трипсинизированную или неревиваемую клеточную культуру, высокочувствительдую к дифтерийному токсину,Однослойную клеточную культуру в пробирках или в пенициллиновых флаконах припосевной дозе от 400 000 до 500 ООО клетокна миллиметр среды под резиновыми пробка-,ми готовят общепринятым способом ици получают готовую из лаборатории культур кле 15ток.В качестве среды выращивания для перевиваемых клеток берут среду 199 с 10% сь 1- воротки крупного рогатого скота и антибиотиками (пенициллин 100 ЕД/мл, стрептоми 20баян 50 ЕД/мл), для первично-.трипсинизированных клеток 0,5%-ный раствор гидролизаталяктальбумина на основе солевого раствораХенкса с 10% сыворотки крупного рогатогоскота и антибиотиками в той же концентра 25пии. Все манипуляции с клеточной культуройи депонируемым штаммом коринебактерийдифтерии проводят в асептнческих условиях,Депонируемый штамм коринебактерий диф терии в количестве 0,2 - 0,3 мл бульонной культуры, например на мертеновском бульоне,вносят в пробирку с клеточной культуройсо сформировавшимся монослоем, предварительно удалив ростовую среду. Затем в пробирку с клеточной культурой добавляют под.держивающую среду, отличающуюся от средыдля выращивания отсутствием сыворотки иантибиотиков. Пробирки с инокулированнойклеточной культурой инкубнруют в термостате при 37 С в течение 4 сут для накоплениямикробной массы, Независимо от токсигеннос Пти коринебактерии дифтерии в течение этогосрока инкубации обильно размножаются,В случае токснгенных штаммов наблюдаетсяцитотоксический эффект. Микробную культурувместе с клеточным материалом из 5 или 10 45пробирок сливают в одну из пробирок и подрезиновой пробкой переносят в холодильникна длительное хранение при температуре от 4до 10 С.Проведен опыт хранения производственного 5 Оштамма коринебактерий дифтерии РЮ 8 Торон 4то, в культуре фибробластов человеческого эмбриона с 0,5%-ным раствором гидролизата лактальбумина на протяжении 9 лет, без пере- севов, при температуре от 4 до 100 С.Предлагаемый способ позволяет хранить. депонируемые коринебактерии дифтерии в кле точном материале фибробластов человеческого эмбриона, без периодических переносов и ли офильного высушивания в течение 9 лет, сох. раняя при этом высокую жизнеспособность штамма, что подтверждается обильным ростом коринебактерий дифтерии при посеве на бульон Мартена, Мартен-Хоттингера и сын ороточный агар, а также сохраняются при этом типичные морфологические признаки коринебактерий диф. терни н биологические свойства в том числе антигенные (по реакции флокуляции), токсич ные по цитотоксичности) .Хранение в клеточной культуре позволяет сохранить производственный дифтерийный штамм РЧ.8 Торонто, в течение 9 лет в жизнеспособном, биологически активном состоянии. Экономический эффект при этом достигается за счет экономии материальных средств (питательные среды) и трудовых затрат (работа бактериолога), затрачиваемых на периодические пересевы цри хранении на искусственных питательных средах. Формула изобретения Способ хранения СогупеЬастепоп ФрИпепае штамм РйТоронто путем посева взащитную среду с последуюитим инкубированием посева и хранением при 4 - 10 С, о т.л и ч а ю щ и й с я тем, что, с цельюудлинения сроков хранения без периодическихпересовов, штамм засевают в культуру фибробластов человеческого эмбриона и инкубируют в течение четырех дней.Источники информации,принятые во внимание при экспертизе1, Суслова В, С. Влияние условий хранения лиофнлизированных культур на их жизнеспособность. Инструктивно- методические ма.териалы по вопросам контроля и стандартизации биологических препаратов. М 19 б 5,с, 335 - 339,2. Инструкция по бактериологическому ис.следованию на дифтерию. Утверждена приказом МЗ СССР У 580, 26.0 б,1974. Филиал ППП "Патент , г, Ужгород, ул. Проектная, 4 ВНИИПИ Заказ 291/37 Тираж 504 Подписное