Способ диагностики сифилиса

О П И С А Н И Е (и)833206ИЗОБРЕТЕНИЯ Союз СоввтскккСоцкалксткчвсккиРеслублкк АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВ 61) Дополнительное к 22) Заявлено 18.06.79) 2783656/28 исоединением заявки3) Приоритет еудеретееииый комитет СОСУ е деиаы изебретеиий(53) УДК 616-002. .6 (088.8) 81. Бюллетеньописания 06.06.81 публиковано 30.05 ата опубликования терытий КимР. А. Капк теин Заявитель Ташкентский государственный ордена Трудово Знамени медицинский институт снога НОСТИКИ СИФИЛИС(54) СПОСОБ Изобретение относится к медицине и касается диагностики раннего врожденного Сифилиса,Известен способ диагностики сифилиса путем исследования нейтрофилов периферической крови 1).Однако способ не является строго специфичным, так как аналогичные изменения ферментов могут возникать и при других состояниях (различные инфекционные заболевания, болезни с обменными нарушениями и пр.) и не позволяет диагностировать заболевание на ранней стадии. Кроме того, спо.соб технически сложен и не всегда выполним в лабораториях общеклинического профиля.Цель изобретения - ранняя диагностика заболевания.Поставленная цель достигается тем, что согласно способу диагностики сифилиса путем исследования нейтрофилов периферической крови кровь инкубируют с ультра- озвученной бледной трепонемой и определя. ют показатель повреждения нейтрофилов и при показателях повреждения нейтрофилов от 0,2 до 0,4 диагностируют выраженные, а при показателях от 0,11 до 0,39 - косвенные признаки сифилиса,Способ осуществляют следующим об.разом.При постановке реакции для каждопбольного готовят ряд пробирок. Если используют один аллерген, то достаточно двухпробирок: опытной и контрольной. В контрольную пробирку стерильной микропипеткой вносят 0,02 мл 5%-ного раствора цитрата натрия, в опытную 0,02 мл трепонемального антигена, разведенного цитратомнатрия по схеме: 0,8 мл цельного трепонемального антигена йлюс 0,2 мл 25%-ногоцитрата натрия, Оптимальную концентрациюаллергена устанавливают опытным путем,что удовлетворяет основным требованиямреакции: не вызывает выраженной активности клеток здоровых людей (несенсибили.15, зированных здоровых доноров) и обуславливает интенсивную амебоидную реакциюнейтрофилов крови высокосенсибилизированных больных, страдающих активным йформами первичйого и вторичного сифилисас высоким титром реагентов в КСР и антителв РИТ и РИФ,Для каждой опытной и контрольной пробы микропипеткой набирают 0,08 мл иссле.дуемой крови,и вносят в околодонную часть3206 83 И-НаооФ пробирки (первую каплю отбрасывают). Для получения антикоагулирующего эффекта йробирки слегка встряхивают, закрывают пробками и ставят на 2 ч в термостат при 38. Пробирку, взятую после инкубации для приготовления мазков, снова слегка встряхивают в целях равномерного распределения лейкоцитов во всем объеме крови. Из каждой пробы делают по два мазка средней толщины. Для приготовления мазка используют химически чистые обезжиренные стекла. Подсушенные мазки подвергают в дальнейшем фиксации в спиртовом растворе нитрата кальция с добавлением к нему непосредственно перед фиксацией формалина (на каждые 100 мл 96 этилового спирта берут 1,8 азотнокислотной меди; 0,9 азотно- кислого кальция и 10 мл 40/о-ного формалина), Спустя 40 мин после погружения мазков в фиксатор их.отмывают от формалина в 3-х порциях 96 спирта (по 10 мин в каждой порции). Подсохшие мазки окрашиваются по методике А. Л. Шабодаша (гистохимическая реакция на.гликоген).Основные этапы окрашивания: инкубация (20 - 25 мин) в растворе периодата при комнатной температуре; промывание (2 - 3 мин) в дистиллированной воде; погружение на 20 - 25 мин в реактив Шиффа; обработка в 3-"х порциях сернистой воды (по 2 мин в каждой); трехкратное промывание в дистиллированной воде по 15 мин). Заключительный этап - докраска ядер гематоксилинэозином Эрпиха.Оценка теста (показатель повреждения нейтрофилов ППН) предусматривает просмотр 100 нейтрофилов в контрольном и 100 в опытном мазках, При микроскопии нейтрофилы делят на две категории: нормальные и поврежденные с достаточно объективными проявлениями амебоидной реакции.Результаты подсчета обрабатывают по формуле где Н, - число поврежденных нейтрофиловв опыте;Н - число поврежденных нейтрофиловв контроле;100 - количество просмотренных в мазкенейтрофилов.Для подтверждения специфичности изменений нейтрофильных лейкоцитов при их сенсибилизации к трепонемальному антигену проведено электронномикроскопическое изучение нейтрофилов, инкубированных с указанным антигеном, а также электронномикро скопическое, изучение ультраозвученного трепонемного антигена.С этой целью лейкоцитарную массу, выделенную из крови исследуемого больного, фиксируют в 2,5/-ном растворе глутаральдегида,45 мин с последующей дефиксацией 4в /-ном растворе Со 0 на фосфатном буфере 60 мин при 4 С. Обезвоживание образца производят в спиртах возрастающей концентрации, абсолютном ацетоне и заливают в аральдит или эпон. Срезы, полученные на ультрамикротоме 1,КВ, контрастируют уранилацетатом и нитратом свинца и просматривают в электронном микроскопе . ЕМ.Нормальные нейтрофильныелейкоцитыхарактеризуются гладкой наружной мембраной с единичными небольшими отростками и вдавливаниями. Ядро сегментировано и на ультратонких срезах состоит из двух- трех сегментов, Ядерное вещество равномерно распределено по нуклеоплазме с концентрацией хроматина по периферии ядра у оболочки, В оболочке видны немногочисленные ядерные поры. В цитоплазме .нейтрофилов встречаются в большом количестве рибосомы и полисомы, отдельные профили гранулярного эндоплазматического ретикулума 20 и митохондрии. Последние имеют обычнуюструктуру, некоторые из них с расщепленным матриксом. Наиболее характерной структурой цитоплазмы нейтрофилов являются разнообразной величины, формы и электронной плотности секреторные гранулы.Сенсибилизация нейтрофилов к трепонемному антигену вызывает выраженные изменения клеточной поверхности и внутриклеточных структур.На наружной поверхности появляются ,Зп многочисленные отростки длиной до нескольких микрон, инвагинации цитоплазмы, образования типа псевдополий. Эти изменения видимо свидетельствуют об усилении фагоцитарной активности нейтрофилов. В цито- плазме нейтрофилов, инкубированных с трепонемальным антигеном, появляются. многочисленные вакуоли размером от 0,5 до 10 - 12 мкм, в отдельных случаях эти вакуоли занимают большую часть цитоплазмы. Содержимое вакуолей представляет собой электронно-светлые поля, на фоне которых различаются частички, представляющие собой клеточный детрит, отдельные мембранные комплексы и другие структуры.Проведенные электрднномикроскопические исследования взвеси ультраозвученного 5 трепонемного антигена показывают, что онпредставляет собой различной величины обрывки мембран, клеточный детрит и другие структурные образования, встречаемые в вакуолях нейтрофильных лейкоцитов.В исследованной взвеси трепьнемальногоантигена структурные компоненты располагаются в гораздо большей концентрации, чем в вакуолях нейтрофилов, что объясняется значительным разведением антигена,используемого в реакции.Проведенные электронномикроскопичес кие исследования позволяют утверждать, что нейтрофильные лейкоциты больных с врожденным сифилисом обладают способТаблица3,5+10, 2 76,5+10,268,75+11,12,2+5,7 ет Нет Нет 6,25 6 е 05 0 10,8,8 7,2 3 9,0 4 Кон рол 1,1 7,4 88,9 7,т ностью фагоцитировать частички трепонемного антигена,Было обследовано 66 новорожденных,родившихся от матерей, больных сифилисом,и 18 новорожденных, родившихся от матерейс нормальным течением беременности, Приэтом все дети были подразделены на 4 группы,1 Группа - дети с установленным диагнозом врожденного сифилиса (17);2 Группа - дети с косвенными признаками, стигматами врожденного сифилиса:сомнительные серологические реакции, костные дистрофии, увеличение печени, селезенки, гипотрофия и пр. (16);3 Группа - дети без клинико-серологических проявлений (33);контрольная группа - здоровые новорожденные (18).Сравнительные результаты приведеныв табл. 1 и 2Сопоставление результатов исследованияв указанных группах показывают, что самыевысокие значения реакции ППН (от 0,11 -0,4) у детей с установленным врождениемсифилисоми в группе детей с косвеннымипризнаками врожденного сифилиса, в товремя как у новорожденных без клиникосерологических проявлений значения ППНприближены к результатам контрольнойгруппы. Из табл. 1 следует, что чем выше показатель повреждения нейтрофилов, тем вероятнее диагноз врожденного сифилиса.Так, в группе детей с ранним врожденным сифилисом, подтвержденным положительными серологическими реакциями группа 1), ППН находится в пределах 0,2 О,:.и выше, В контрольной группе такие показатели отсутствуют вообще,Во 2-ой группе (дети с косвенными признаками заболевания и отрицательнымисерологическими реакциями) показательлишь у 4-х детей находится в пределах0,01 - 0,1, а у 12-ти (75 + 12,5) в пределах0,11 - 0,39. При статистической обработкеданных в сравнении с контрольной группойразличия показателей (р = 5%) удовлет.ворительно достоверны.При сравнении данных первых двух групппо методу х различия показателей достоверны (р - 0,05),В 3-ей группе (дети без,клинико-серологических проявлений) показатель у 29-ти(87,8 - 6,0) детей находился в пределах0,01 - 0,19, у четверых - 0,2 - 0,39, В контрольной группе ППН был в пределах 0,01 -0,19 у 18-ти (100%) детей. При статистичес 20 кой обработке в сравнении третьей группыс контрольной результаты недостоверны,Отсюда видно, что величина показателясоответствует форме заболевания (0,2 ивыше - выраженные формы, 0,11 - 0,39 формы с косвенными признаками).Предлагаемый способ дает возможностьдиагностировать сифилис на ранних стадиях,позволяя своевременно подвергнуть больного лечению,Экономический эффект ранней диагностики выражается в возможности сэкономитьмедикаменты и сократитьсроки нахождениябольного в стационаре.833206 Таблица 2 Пределы колебаний ППН мкм у групп Показатели 0,0 в 0,11 - -0,1 -0,19-0,1 О,в 0,2- 0,3 -0,19 -0,39 и вы- ше 0,2- 0,4 -0,39 и вы- ше И м 88,7, 0 О 8,97,4 1, 0 0 8,9 7,4 1,4 007,4 43 30 2,2 О,б 5,9 1,5 б 925 О,ф 14 0 О,ния неитрофилов от 0 2 до выраженные признаки си казателях повреждения не 20 до 0,39 диагностируют ко сифилис.а. Источники инфо приНятые во внимание 1. Авторское свидетель577018, кл.,б О М (20,4 диагностируют филиса, а при пойтрофилов от 0,11 свенные признаки филиса путем испериферической что, с целью ранния, кровь инкуй бледной трепотель повреждения ателях повреждермации,при экспертизство СССР8, 1977. Составитель С.МаТехред А. БойкасТираж 687 люти Редактор Л. Пчелинск Заказ 3843/2 ВНИИПИ Государственногоподелам изобретений113035, Москва, Ж - 35, Рау илиал ППП Патент, г. Ужго ормула изобретения Способ диагностики си следования нейтрофилов крови, отличаощийся тем, ней диагностики заболевабируют с ультраозвученно немой и определяют показа нейтрофилов и при показ Корректор Ю.МакаренПодписноекомитета СССРи открытийшска я наб д. 4/5род ул Проектная 4