Способ получения -лизина

. Удровцарс твССР 337 о ССС971,-ЛИЗИН родуце одержа мешивания ОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИИ(71) Институт микробиологииим. Августа Кирхинщтейна АН(54)(57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ путем культивирования его тов на питательной среде,щей источники углерода, азота и необходимые питательные соли, при аэрации среды, перемешивании и поддержании заданного значения рН с последующим выделением Ь-лизина, о т л ич а ю щ и й с я тем, что, с цельюувеличения выхода Ь-лизина, в процессе ферментации, начиная с 16 по30 час культуральной жидкости определяют концентрацию молочной кислоты или активность лактатдегидрогеназы, при этом при определении концентрации молочной кислоты в культуральной жидкости и достижении ее0,3 - 0,5 мас.7 или при определенииактивности лактатдегидрогенаэы и достижении ее 10 - 30 уд. ед, доводятрН культуральной жидкости до заданного значения путем регулированияколичества подаваемого воздуха и пеИзобретение относится к микробиологической промьппленности и можетбыть использовано для управленияпроцессом получения лизина,Известен способ управления процессом биосинтеэа 5 лизина, при котором рН среды поддерживают в заданныхпределах в зависимости от концентрации,анионо-органической кислоты,например уксусной, рН среды регулируют вводом в нее углекислого газаили бикарбоната натрия Я .Наиболее близким иэ известныхспособов к изобретению является способ получения лизина, заключающийся 1 Юв том, что получают Ь-лизин путемкультивирования его продуцентовна питательной средне, содержащейисточники углерода, азота,и необходимые питательные соли при аэрации 20среды, перемешиванйи и поддержаниизаданного значения рН с последующимвыделением лизина 2.При регулировании процесса в ста-дии образования биомассы в ферментаторе условия близки к полному перемешиванию и регулирование по рОпри концентрации кислорода 30 - 403насыщения обеспечивает достаточноточное регулирование по всему ап- ЗОпарату, но в стадии биосинтеза принасыщении кислородом 5 - 1" . в аппарате уже не обеспечиваются условияполного перемешивания и нельзя од"нозначно установить значения рО повсему объему, что является недостатком этого способа.Недостаток кислорода в клеткахпереключают метатолизы углеводов отаэробного процесса на анаэробныйВ 4 Орезультате этого под действием лактатдегидрогеназы образуется молочнаякислота, Таким образом метаболитыуглеводов не включаются в цепь синтеза лизина, а используются на образование побочных метаболитов, например молочной кислоты.Целью изобретения является повышение точности управления процессомполучения лизина, а также увеличениевыхода целевого продукта,Поставленная цель достигается тем,что по предложенному способу в процессе ферментации, начиная с 16 по30 час в культуральной жидкости оп- уределяют концентрацию молочной кислоты или активность лактатдегидрогеназы, в клетках продуцента при этомКукурузныйэкстракт 1040 кг (при содержании 507 сух.вв.) при определении концентрации молочной кислоты в культуральной жидкости и достижении ее 0,3 - 0,5 мас,Е или при определении активности лактатдегидрогеназы и достижении ее 10 30 уд. ед, доводят рН культуральной жидкости до заданного значения путем регулирования количества подаваемого воздуха и перемешивания.Способ осуществляют следующим образом.В качестве продуцента 1.-лизина используют микроорганизмы ВгечаЪасСегацш или М 1 сгососсоз.После выращивания культуры в посевном ферментаторе дальнейшее культивирование проводят в производственных ферментаторах на углеводной питательной среде, например мелассной. При ферментации во время роста продуцента рО поддерживают на уровне 20 - 5 Ж насыщенияНачиная с 16 ч определяют концентрацию молочной кислоты в культуральной жидкости или активность лактатдегидрогенаэы в клетках продуцента. При достижении концентрации молочной кислоты 0,3 - "5 мас.Х или активности лактатдегидрогенаэы 10 - 30 уд. ед., в результате чего снижается значение рН, повышают интенсивность аэрации и перемешивание до достижения рН 1,4 - 8,0.На 3) - 36 часу при резком снижении рН его поддерживают добавлением аммиачной воды или мочевиной с таким расчетом, чтобы концентрация азота не превышала 0,2 - 0,4 мас,7., После окончания культивирования из культуральной жидкости выделяют 1. - лизин известными методами или полу" чают кормовой концентрат лизина.П р и м е р 1. Исходную культуру Вгеч 1 Ьасгегцш зр 22 ЛД размножают вначале на агаровых косяках, затем в колбах на качалке и в посевном ферментаторе. Затем посевной материал передавливают в производственный ферментатор емкостью 5000 л со стерильной средой 32000 л. Питательная среда имеет следующий состав:Меласса 6500 кг (при содержании сахара46 мас.7)6668747,0 увеличивают число оборотов мешалки нли расход аэрирующего воздуха додостижения рН 7,4 " 7,8 м парциального давления кислорода 257 насыщения, После 30 - 36 часа ферментации рН поддерживают аммиачной водой.На 54 часу ферментации культуральнаяжидкость содержит Ь-лизина 38 г/л,биомассы продуцента Ь"лизина 19 г/л,:1 О концентрация сухих веществ в культуральной жидкости 15,0 мас.7., остаточные сахара 0,6 мас.Х, молочнаякислота 0,3%.П р и м е р 3. В качестве продуцента используют культуру Вгеч 1 Ъассегшш 22. Ферментацию осуществляютв ферментаторе емкостью 15 л на среде следующего состава:Меласса 1,52 кг (при со О держании сахара 46 мас.Х),Кукурузныйэкстракт 0,25 кг (присод. 503 вессух. в-в) 5 г В начале ферментации аэрация 0,81 объем воздуха /объем культуральной жидкости, обороты мешалки400 об/мин, расход воздуха и интен сивность перемешивания постепенноувеличивают до 1 ; 1 и 800 об/мин к8 часу ферментации, рОг поддерживаютна уровне 20 - 257 насыщения. РегуАммоний хлористый 700 кгАммоний фосфорнокислыйдвухэамещенный 30 кгВода До 32000 лФерментацию проводят при 31 ++ 1 С, в стадии роста рН среды поддерживается в пределах 6,8 - 7,8рО - на уровне 227 насыщения, На16 часу культивирования определяютактивность лактатдегидрогеназы вклетках продуцента. Активность22 уд. единиц, рН снижалась до 7,0,Увеличивают расход воздуха на 57, рНустанавливается 7,6 и не меняется,через 3 часа культивирования опятьопределяют активность лактатдегидрогеназы - активность 6 уд. ед,Объем воздуха остается прежним.В дальнейшем активность лактатдегидрогеназы определяют через каждые 3 ч культивирования. При увеличении активности лактатдегидрогеназы увеличивают расход воздуха илиинтенсивность перемешивания, поддерживая рН на уровне 7,4 - 8,0 и рОу,на уровне 20 - 257. насыщения. Начиная с 36 часа культивирования рНЗОсреды поддерживают добавлением аммиачной воды.Во время ферментации при достижении величины РВ 57 добавляют стерильную массу в расчете 2 мас.7 по РВ35и продолжают ферментацию до полногоиспользования редуцирующих веществ.На 54 часу ферментации культуральная жидкость содержит Ь-лиэина 39 г/л,биомассы продуцента Ь-лиэина - 20 г/лконцентрация сухих веществ в культуральной жидкости 14,6 мас.7, остаточные сахара - 0,753, молочная кислота - 0,27, После окончания ферментации культуральная жидкость обрабатывается одним из известных способов. П р и м е р 2, В качестве продуцента Ь-лиэина используют микроорганизмы Мсгососсцз е 1 цашсцз Т-З,Культивирование ведут на среде, 5 О аналогичной примеру 2, В качестве стимуляторов роста используют гидролизат белково-витаминного концентрата.Активность лактатдегидрогенаэы определяют начиная с 16 часа культивирования. При превышении активности 10 уд, ед. и снижении рН до Сульфат аммония 150 гФосфат аммония двузамещенныйКарбонаткальция 25 гПодсолнечноемасло 30 млНа 4,6 л среды вносят 0,4 л посевного материала, т,е. 8 Х объемных с содержанием биомассы 18 г/л. Содержание РВ в начале ферментации 12 мас.й, рН - 6,8, температура + 31 + 1 С, Во время роста продуцента роа поддерживают на уровне 207 насыщения. На 8 часу рН увеличивается до величины 7,8 и поддерживают на этом уровне до 20 час аэрацией н перемешиванием, После достижения концентрации РВ в культуральной жидкости 57. производят периодическое добавление источника углерода (мелассы, уксусной кислоты, сахарозы, спирта, двойной соли глкозы).666874 Редактор Л.Утехина Техред З.Палий Корректор К,Зрдейи Заказ 7022/2 Тираж 524 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб д. 4/5Филиал П 1 Ш "Патент" г.ужгород, ул.Проектная, 4 лярно каждые 3 ч определяют концентрацию молочной кислоты и по ней судят об активности лактатдегидрогеназы, При достижении концентрации молочной кислоты в среде 0,4 мас.7 что соответствует увеличению активности лактатдегидрогеназы в клетках 16 уд. ед, увеличивают интенсивность аэрации и перемешивания. При продолжении ферментации, в частности, после добавления источника углерода, р 0 снижается до 3 - 57 насыщения, рН уменьшается до 7,0, активность лактатдегидрогеназы увеличивается до 50 уд. ед, и активность биосинтеза Ь-лизина падает от 0,09 г/л ч до 0,05 г/л/ч на 1 г биомассы, При этом увеличивают аэрацию до 1,21, активность лактатдегидрогеназы уменьшается до 6 уд, ед. и активность биосинтеза увеличивается до 0,09 г/л/ч на 1 г биомассы. После 30 часа ферментации рН поддерживают 30-ным раствором мочевины, которая одновременно служит источником азота.Во время ферментации определяютсодержание азота, содержание которого не должно превышать 0,2 -0,4 мас.71 О К 60 часу ферментации культуральная жидкость содержит Ь-лизин 56 г/л,биомассы продуцента 24 г/л, концентрация сухих веществ 18 мас.Е, остаточные сахара - 0,9 мас,З, молочная 5 кислота - 0,1 Ж.Предлагаемый способ позволяет увеличить выход Ь-лизина на 307 за счетснижения количества побочных продук"тов метаболизма и сократить общее 2 О время ферментации на 10 - 16 ч. Прииспользовании способа повысился экономический коэффициент биосинтезаЬ-лизина.