Способ получения -лизина

638268 ОЛ ИСАНИЕИЗОБРЕТЕН ИЯК ПАТЕНТУ Союз Советских Социалистических Республикпо делам изобретений и открытий(45) Дата опубликования описания 22,01.9(72) Авторы из обр егери я Иностранцы Осаму Тосака, Хадзиму Мориока, Хаяо Хиракава,Кендзи Исии, Кодзи Кубота и Есио Хиросе(Япония) Иностранная фирма Адзиномото КО ИНК(Я) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ .-Л И 3 И НА Изобретение относится к области микробиологической дромышленности, к технике получения .-лизина при помощи ферментац,ии.Известен способ получения .-лизина путем атьвращивания продуцирующих его микроорганизмов,на питательной среде, содержащей источники углерода, азота, необходимые минеральные соли, в присутствии стимуляторов роста с последующим выделением .-лизина из культуральной среды 11.Известный способ,не обеспечивает достаточно высокого выхода ародукта.Целью,изобретения является повышение выхода 1 -лизина. Это достигается тем, что,в предлагаемом способе получения 1.-лизина в качестве микроорта 1 низмов, продуцирующих .-лизин, используют штаммы ВгеиЬасег 1 цгп 1 асгоегтпепцгп ГЕЙМ-Р 3382, ГЕЙМ-Р 3383, ГЕЙМ Р 3384, ГЕЙМ-Р 3386, ГЕРМ-Р 3387 или СогупеЬас 1 егцтп асе 1 од 1 ц 1 агпгсцгп ГЕЙМР 3380, ГЕЙМ-Р 3381 или ГЕЙМ-Р 3414, устойчивые по отношению,к а-аминолауриллактаму, у-метиллизину или Х"-карбобензоксилизину.Кроме того, используют штаммы, стойкие к Б- (2-аминоэтил) -.-цистеину. Способ осуществляют следующим образом.Лактофермент ВгейЬасегпцп, АТСС13869 подвергают возлействию 250 гнг/гил5 Х-метил-Х-нигро-Х-,нитрозогуанидина прц30 С 30 лшн.Обработанные штаммы наносят на плоскую агаровую среду А слелующего состава,г/дл: глюкоза 2; карбамид 0,3; (ХН 4) г 504 1;10 КНгР 00,1; Ми 504 7 НгО 0,04; ГеЯО,ХХ 7 НгОгнг/дл; Мп 504 4 НгО 1 гнгдл; биотпн 50 иг/л; тиамин НС 100 гиг/л; агадир 2;1 " -карбобензоксилизин 0,1.Образовавшиеся на плоской среде,коло 15 нии разделяют и нз колоний отЛеляют продуцент лизина м таит А 1 3985, другие мутанты отлеляют таким же образом,Микроорганизмы выпрашивают на среде 20 А при 30 С 24 час, выращенные клетки собирают, промывают средой Б, а затем суспенлируют в среду В, Среда Б имеет слелуюший состав, г/дл: экстракт дрожжей 1; пепгон 1; ХаС 0,5; глюкоза 0,5; агар 2,0 (рН 7,О). Среда В имеет следующий состав, г/дл:глюкоза 2; (МН 4) г 504 1; КНгР 04 0,1; Мд 5047 Н,О 0,04; ХаС 0,05; СаСОз 3; ЗО ГеЯО 7 НгО 1 гиг/дл; Мп 504 7 НгО 1 гиг/дл638268 Таблица 1 Химические добавки Относительный ростМикроорганизм название количество 100 21 9 2А 3984 47 ф АТОС 13869 является исходным штаммом для А 13985, А 3986, А 3987, А 13988, А 3989 и А 13990."ф А 1 3989 и А 1 3990 выращиваотся в среле Б, содержащей, кроме того, 500 лг/.ил .-аланнна и 5 игал;.г никотинамида.АТСС 15806 является исходным штаммом лая А 3991, А 13983 и А 1 3984. стерилизованный); биотин 50 мг/,г; тнамин . НС 200 мгл рН 7,0),каждыми 0,1 мл взвеси клеток засевают 3 мл среды В, содержащей определенное количество и-аминолаурчллактама (АЛЛ), у-метиллизина (МЛ) или Х "-карбобензоксилизина (КБЛ), ги микроорганизмы выраА 3445 (АЕСу) является мутантом, производящим Ьлнзин, вида лактофермент ВгеиЬас 1 егцпт, который не ооладает стойкостью:по отношению к КБЛ, МЛ или АЛПолученные мутанты могут производить большое количество 1.-лизина в среде даже в том случаекогда обладают только теми ха,рактеристиками стойкости к АЛЛ, .ЧЛ ".: КБЛ, которые приведены выше: Если опи ,имеют дополнительную стойкость по отно цдению к 5-(2-аминоэтил) - 1. - цистеину (АЕС) или потреблению аланина, то производство 1.-лизина значительно возрастает. щивают в пробирке на 10 мл чри 30 С 20 час при периодическом взбалтывании.В процессе выращивания рост, взвеси определяют, измерением оптической плотности в 562 мм бульона культуры, разбавленной 1: 26, В табл. 1 приведены полученные результаты. В качестве источника углерода могутбыть использованы карбогидраты: глюкоза 10 сахароза, меласса или гидролизат крахмала; органические кислоты: уксусная, пропионовая или бензойная; спирты: этанол, пропанол; а для,некоторых штаммов - угл во 1 дородь.15 В качестве источника азота можно использовать аммиак, сулъфат аммония, нит рат аммонияфосфат аммония, мочевину Т. д.В качестве ростовых веществ можно использовать гид 1 ролизат соевых бобовпшеМикроорганизм А 3985 А 3986 А 1 3987 А 1 3988 А 3989 А 1 3990 А 1 3445 2,0 1,5 27 28 37 36 18 Таолица 4 35 Вил ц 1.-лизина на раскол этилового спирта,о, Количество накопившегося 1.-л из шш,г,пМпкроорганизгч А 1 3983 А 1 3989 А 3990 А 3445 85 о 6 94 4 яичный концентрированный,раствор, экстракт дрожжей или,пептон.Выращивание осуществляют в аэробных условиях при 24 - 37 С в течение 2 - 7 лней при рН 5 - 9, поддерживаемом добавлением щелочикислоты, карбоната кальция или газообразного аммиака.1.-лизин отделяют от среды с помощью вонообменных смол или кристаллизацией.П р и м е р 1. 20 мл среды выращивания культуры, состав которой приведен ниже, помещают в колбу емкостью 500 м,г, которую периодически взбалтывают и нагревают до 110 С 5 мин.Состав среды, г/дл: глюкоза 10; сульфат аммония 5; КНзР 04 0,1; Мд 5047 НО 0,04; г.ес 104. 7 Н,О 1,0 мг/дл; Мп 504 4 Н,О 1,0 мг/дл; биотин 5,0 мг/дл; тиамин НС 1 20,0 ма/дл; гидролизат соевых бобов 1,5 мг/дл (общее содержание азота 7%); карбонат кальция (стерилизованный) 5% (рН 7 0),Каждый вирд микроорганизмов, приведенных в табл. 2, прививают,на среду для выращивания,культуры и температуру,среды,поддерживают на уровне 31 С 72 час, при этом периодически,взбалтывают.Таблица 2 После завершения процесса выращивания опрелеляют общее содержание 1.-лизина в,полученном таким образом медиуме (з табл. 2 это количество приведено в виде гилгрохлорила 1.-лизина).П р и м е р 2. СогупеЬас 1 егшгп асе 1 одп 1 апг 1 сигп А 1 3983, А 1 3984, А 1 3991 или АТСС 21491 (АЕС) выращивают, как в примере 1. В соответствующей среде для выращивания культуры обнаруживают произведенный 1-лизин в количестве 25, 24, 3,0 и 15 г/л, соответственно.П р и м е р 3. Микроорганггзмы, которые приведены в табл, 3, вырашивают аэробно в 50 мл среды, содержащей вытяжку тгз семян, при 31 С 18 час. 5 10 20 25 30 Состаз среды, содержащей вытяжку цз семян, гдл: глюкоза 1,5; ацетат аммония О,Л мочезггна 0,1; .Л 1 р 804 . 7 НО 0,4; КНзРО 4 0,01; Чп.04 4 Н,.О 1 мггд.г; Ге 5047 НаО 1 мгдл; бцотцн 50 мг/.г; тцамцн НС 200 мг/л; гцлролцзат соевых бобов 3 лиг,д.г (общее содержание азота 7% рН 7,5).Триста частей среды для выращцванц.т культуры, состав которой прпвелен,выше, помещают в сосул,лля ферментаццц объемом 1 л, нагревают, а затем в сосул вносят 15 м.г бульона среды состава, г,дл: глюкоза 2; ацетат аммония 0,5; смочевнна 0,2; (Н) 504 0,5; КН.РО 0,1; Мд 5047 НзО 0,04; Ге 50 7 Н.0 1 мг/дл; МпЬО 4 Н,О 1 мгд,г; бцотцн 50 лгг.г; тцамцн бО лгг/.г; гилролцзат соевых бобов 3 лгг/д г (рН 7,5).Выращпвангие осуществляют аэробно при 30 С. В процессе выращивания добавляют золный раствор, солержащчгй уксусную кислоту и ацетат аммониялля поллержания,рН среды на уровне 7,2 - 8.0.Спустя 72 час з пгроцессе выращивания в образозавшейоя таким образом среде накапливается 1.-лизин, общее количество которого приведено в табл. 3.гП р и м е р 4. Чцкроорганцзхгы, приведенные з табл. 4, выращивают аэробно при 31 С з течение 18 час в 50 мл срелы для выпрашивания культуры согласно примеру 3 с лобавленцем 0,5 г,д,г этилового спирта и 0,3 г/д.г мочевины вместо 0,3 г/дл ацетата аммония и 0,1 г,дл мочевпны. Порлцц объемом 300 мл той же срелы, которую используют в примере 3, с концентрацией глюкозы 1 г,дл и лобавленцегм 1 г дл этислозого спирта вместо 0.5 г,д.г ацетата аммония, помещают з сосул лля ферментацци, объемом 1.г и госуд нагревают. Срелу для вырашцзанця культуры помещают в бульон семенной культуры объемом 15 лл, состав которой прцзелен выше. Выраш ванне осуществляют аэробно прц 31 С.В процессе выращивания рН средь полдержизают 7,2 - 8,2 прц помощи газообразного аммония. Концентрацию спирта з среде лля зырашцзан:гя культуры периодически контролируют прц помощи газовой хроматографии, поддерживая на уровне 0,3 г дл полпгцткой этцлозым спиртом.Предлагаемый способ обеспечивает по сравнению известным повышенный выход 1.-лизина.."1 икрооргаиизм меласса свеклы меласса тростника 19 27 29 37 18 23 25 А 1 3445 А 3937 А 3988 А 3989 АТСС 21491 Л 1 3983 А 3984 20 27 30 39 20 26 27 Формула изобретения Составитель А. Бражникова Текред С. Антипенко Корректор С. файн Редактор Е. Хорина Заказ 989/1567 Изд. Мо (91 Тираж 526 Подписное НПО Государственного комитета СССР ио делам изобретений и открытий 13035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5Тип, Харьк. фил, пред. Патент Выращивание осуществляют 5 б час. В табл. 4,приведены количества 1.-лизина, которые были найдены в соответствующих средах. П р и м е,р 5. Приготавливают среду для,выращивания культуры, состав,которой приведен, ниже, и 20 мл среды помещают в ,колбы объемом 500 мл, середу нагреваютпериодически взбалтывался. Приготавливают 1,г бульона, засеянного микроорганизмами вахида А 1 3989, как описано выше, затем засеянный бульон помещают в центрифугу для извлечения клеток;,всплы,вающую часть среды обрабатывают кислой понообменной смолой АгпЬег 1 Ие 1 К. Абсорбированный на смоле 1.длизин вымывают 3/виной аммиачной водой, а из элюата извлекают кристаллы двугидрата гидрохлорида 1.-лизина (28,5 г). 1. Способ, получения 1.-лизина путем вы 1 ращивания продуцирующих его м 1 ироорганизмов на питательной среде, содержащей источники углерода, азота, необходимые минеральные соли, в присутствии стимуляторов роста с последующим,выделением 1.-лизина культуральной среды, от л ич а юСостав среды, гдл; меласса свеклы илнмеласса тростника 10 (источник глюкозы);сульфат аммония 5; КНРО 0,1; МоЬОХх 7 Н;О 0,04; биотин 0,5 пгл; СаСОз 5 г/дл5 (отдельно стерилизуют),Середу засевают микроорганизмами, которые приведены в табл. 5, и,выдерживаютпри 30 С 72 час, периодически, взбалтывая,Полученная среда содержит 1 -лизин в10 количествах, которые, приведены в табл. 5. 10 щ и й с я тем, что, с целью повышения,выхода, в качестве микроорганизмов, продуцирующих 1.-лизиниспользуют штаммы ВгеиЬас 1 ег 1 шп 1 асто 1 еггпептпгп ГЕКМР 3382, РЕКМ-Р 3383, ГЕКМ-Р 3384, 15 ГЕКМ-Р 338 б, ЕЕКМ-Р 3387 или СогупеЬас 1 еггцп 1 асе 1 од 10 аписигп ГЕКМ-Р 3380, ЕЕКМ-Р 3381 или ЕЕКМ-Р,3414, устойчивые по отношению,к а-аминолауриллактаму, 7-мети ллизину,или К -,карбобензокси лизину.2. Способ,по п. 1, отл,ич аю щи йсятем, что,используют штаммы, стойкие к 5- (2-аминоэтил) -1.-,цистеину. 25 Источник информации, принятый во внимание при экспертизе: 1. Авторское свидетельство СССРЛа 378411, кл. С 12 Р 1,3/Об, 1971.