Способ получения противоящурной гоа2 формолвакцины из лапинизированного вируса

п 11 561732 ОПИСАН И Е ИЗОБРЕТЕНИЯ К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ Союз Советских Социалистических Республикосударственныи комитет Совета Министров СССР о делам изооретени и открытий(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОТИВОЯЩУРНОИ ГОЛ-ФОРМОЛВАКЦИНЫ ИЗ ЛАПИНИЗИРОВАННОГО ВИРУСАИзобретение относится к способам изготовления биологических препаратов для вакцинации сельскохозяйственных животных и может быть использовано в биологической промышленности для получения авирулентной, безвредной и высокоиммуногенной противоящурной вакцины.Известны способы изготовления противоящурной гидроокисьалюминиевой формолвакцины из афтозного, культурального и лапинизированного вируса 11. Известная технология изготовления протпвоящурной вакцины из лапинизированного вируса включает следующие операции: приготовление вируссодержащей суспензии, сорбцию вируса на гидро- окись алюминия с последующей инактивацией формалином и теплом. В качестве дополнительного адъюванта применяется сапонич. Противоящурная вакцина из лапинизированного вируса, изготовленная указанным способом, отличается слабой иммуногенностью и в большинстве случаев создает у привитых животных недостаточно напряженный иммунитет. Многочисленные попытки усовершенствовать вакцину не увенчались успехом. 25Известен также способ изготовления противоящурной ГОА-формолвакцины из лапинизированного вируса, используемый биологической промышленностью СССР и являющий:я наиболее близким по технической суцтно сти к предлагаемому способу 2. Вируссодержащую суспензпю готовят из тушек 2 - 3 дневных крольчат на 1/15 М фосфатном буфере в отношении 1: 10. После размола и экстрагирования в суспензию добавляют 5% хлороформа, который тщательно эмульгируют в суспензии с помощью коллоидных мельниц, Хлороформ и денатурированные белки удаляют сепарированием или центрифугированием,Затем вирус ящура двукратно концентрируют сорбцией на гидроокисп алюминия. Суспензию гидроокиси алюминия готовят на дистиллированной воде. Процесс концентрации вируса ящура на гидроокпси алюминия контролируют проверкой сорбппп вируса и комплементсвязывающего антигена. Концентрация считается полной при сорбции вируса не менее 99% и комплементсвязывающего антигена не менее 90%. После этого постепенно добавляют 5%-ный раствор формалина при постоянном перемешивании. Инактивацию вируса ведут при 25 - 26 С в течение 48 ч. После окончания инактнвации в реактор добавляют под давлением глицерин, 10%-ный раствор хинозола и 10% -ный раствор сапонина. Все компоненты перемешивают в течение 30 мин, рН вакцины устанавливают в пределах 7,6 - 7,8 путем добавления (1 или 5%-ного) раствора химически чистой соляной кислоты. Вакцину охлаждают до 4 - 6 С. Основным недо561732 рассасывается на Таблица 1 Иммуногенная активность ГОА-формолвакцины,изготовленной на различных растворахИмД; для мышей, мл опыты Растворы И Хенкса+0,5% ГЛА Эрла+0,5 О, ГЛАТироде+0,5 О, ГЛАДульбекко+0,5 ГЛА Фосфатиый буфер 0,12 0,10 0,11 0,13 0,60 0,13 0,14 0,11 0,15 0,36 0,120,01 0,120,02 0,11 0,01 0,160,04 0,48,-О, 07 0,12 0,12 0,12 0,19 0,48 статком Гротив 051 щур 11011 вакципь 1 из,1 апинизированного вируса и в особенности типа О, изготовленной на 1/15 М фосфатном буфере, является то, что она обладает весьма низкой иммуногенной активностью, не создаст продолжительности иммунитета у ссльскохозяйственных животных и при многократном применении вызывает большие трудности,С целью повышения иммуногенной активности противоящурной ГОЛ-формолвакцины из лапинпзированного вируса, предлагают в известном способс изготовления противоящурпой ГОЛ-формолвакципы из лапинизпрованного вируса, включающем операции культивирования вируса, приготовление вируссодержа щей суспензии, ее экстр агирования и эмульгирования, очистки вируса, добавления гидроокиси алюминия для сорбции вируса и его инактивации, вируссодержащую суспензи 10 отоить на соленом изотоничсском растворе, например, Хенкса, Эрла, Тироде или Дульбекко с добавлением 0,5% гидролизата лактальбумина или казсипа, При этом гидро- окись алюминия добавляют к вирусу после очистки, предварительно приготовленную па солсвом пзотОГи 1 сском растворе Хспеса,Противоящурпая ГОЛ-формолвакцппа, полученная предлагаемым способом, прсвь 1 шаст в 2 - 4 раза по активности вакцину, приготовленную известным способом, Высокая иммуногенпость вакцины, полученной предлагаемым способом, по мнению авторов изобретения обусловлсна тем, что в процессе инактивации сохраняются антигснные и иммуногснпые свойства вируса за счет стабилизации сго солями кальция, магния и аминокислот гидролизатовнаходящихся в солевых изотопических растворах, Кроме того, вакцина, полученная предлагаемым способом, не обладает Из таблицы 1 следует, что ГЛО-формолвакцина из лапинизированного вируса 0 в 1, изготовленная на фосфатном буфере (контрольная), отличается низкой иммуногенностью, средняя ИмД 5 о трех серий составляет 0,48+0,07 мл. Лктивность ГОЛ-формолвакцины из лапинизированного вируса 0 - 194, изготовленной на растворах Хенкса, Эрла, Ти 10 15 20 25 30 35 реактогенностью и легкоместе введения.Для изготовления ГОЛ-формолвакцины использовали лапинизированный вирус ящура типа О, штамм 194,3 - 10 пассажей, адаптированный к крольчатам двух-трехдневного возраста. Было изготовлено и испытано 15 экспериментальных образцов вакцины из лапинизированного вируса типа О, из которых 12 па соленых изотон растворах Хенкса, Эрла, Тиродс, Дульбекко с 0,5%-ным гидролизатом лактальбумина фирмы Дифко (по 3 образца), и 3 серии в качестве контроля на фосфатпо-буферном растворе. Лвиарулентность всей серий вакцины контролировали на мышатах-сосунах, иммуногенность - путем определения 50% иммунизирующих доз (ИмДво) вакцины для взрослых белых мышей. При этом мышам вакцину вводили в области спины в цельном виде и в разведениях 1:2, 1: 4, и 1: 8, доза 0,8 мл. Каждой дозой вакцины прививали по 20 мышей, а в качестве контроля оставляли такое же количество невакципированных животных. Через 21 день после вакцинации привитых и контрольных мышей заражали подкожпо в дозе 10000 ЛД 5 о/мл индикаторным штаммом вируса, адаптированным к этому виду животных. Учет результатов проводили в течение 10 дней по количеству выживших мь 1 шей к общему числу привитых животных, 50%-ную иммунизирующую дозу вакцины рассчитывали по методу Кербера-Лшмарина.В результате проведенных опытов уста 1 ловлено, что все серии вакцины были авирулентными и безвредными, Данные контроля иммуногенности вакцины на взрослых белых мышах представлены в табл. 1. роде, Дульбекко с 0,5%-ным гидролизатором лактальбумина повышается от 3 до 4 раз, по сравнению с контрольной, Различие статически достоверное (В(0,01). В то же вовремя не отмечсно существенных различий в активности вакцин, изготовленных на любом из изотонических солевых растворов с гидролизатом лактальбумина.Ы 132 Таблица 2Показатели иммуногенности ГОА-формолвакцины в зависимости от вида гидролизатов ИмД, для мышей, мл опыты Растворы и гндролнзаты 1 П фосфатный буферХенкс+0,5% ГЛА Лифко"Эрла+0,5% ГЛА ферак"Хенкс+0,5% ГЛА Олайнскпй"Эрла+0,5% ГЛА Цолипк" 0,290,02 0,12 0,02 0,11 0,001 0,130,02 0,110,01 0,30 0,13 0,13 0,12 0,09 0,24 0,12 0,10 0,14 0,13 0,32 0,12 0,11 0,12 0,11 Таблица 3 Иммуногенность противоя 1 цурной вакцины типа 0-194,приготовленной на соленом изотоническом растворе с добавлением гидролизатаРезультаты контрольного заражения Серия вакцины,г 1 оГенерализованные Первичные афты Не заболели 201 203 Контроль Была испытана иммуногенная активность 12 серий ГОА-формолвакцины из лапинизированного вируса ящура типа 0 - 194, изготовленной на солевых изотонических растворах Хенкса и Эрла с гидролизатами лактальбумиПолученные результаты на взрослых мышах были подтверждены и в опыте на крупном рогатом скоте. С этой целью па крупном рогатом скоте была испытана иммуногснность двух опытных серий противоящурной ГОА- формолвакцины из лапинизированного вируса типа 0 - 194. Серия 201 пригото 1 влена па растворе Тирода с 0,5%-ным гидролизатом лактальбумина фирмы Дифко, и серия 202 на растворе Хенкса с 0,5% гидролизатом казеина, производства Олайнского завода.Иммуногенность вакцины определяли на 6 животных (по 3 головы крупного рогатого скота на серию), которым прспарат вводили Следовательно, противоящурная ГОА-формол 1 вакцина из лапинизированного вируса типа 0 в 1, изготовленная на солевом изотоническом растворе Хенкса, Эрла, Тироде или Дульбекко с добавлением 0,5%-ного гидролизата лактальбумина или казеина является авирулентным, безвредным и иммуногенным препаратом,6на Дифко, Ферак, казеина Олайнский и Цолипк. В качестве контроля служили вакцины, изготовленные на фосфатном буфере (3 образца). Результаты контроля иммуно генности вакцины представлены в табл. 2. подкожно в области верхней трети шеи в дозе 4 мл. 11 а 21 день после прививки крупный 25 рогатый скот заражали гомологичным вирусом я 1 цура в дозе 10000 ИДзо/0,2 мл в слизистую оболочку языка. В результате испытани 51 Вакцины па круппом рогатом скоте установлено (таблица 3), что обе серии вакцины 30 обладалп выраженной пммуногенностью. Так,пз 6 привитых животных 4 головы не заболели ящуром, а у двух отмечены первичные афты на месте введения вакцины.Контрольные животные (2 головы) заболе.35 ли ящуром с генерализацией процесса через48 - 72 ч. Была показана возможность повышенияиммуногенности 12 серий противоящурной 60 ГОА-формолвакцины из лапинизированноговируса типа А 550 за счет использования солевых изотонпческнх растворов с гидролизатами.П р и м е р, Противоящурную ГОА-формол вакцину готовилп следующим образом: лапиФормула изобретения 20 Составитель А. Алексеенок Техред Релактор Л, новожилова Ива554 Тираж 563 подписное:ГСугр - ;о о ис: ттс Совета Министров СССР по лолам пообрстснпй п открытии 113035, Москва, 7 К, Раушская наб., д, 4/5169/6 Типография, пр. Сапунова, 2 низированный вирус производственного штам- ма измельчали на мясорубке с последующйМ размолом на размельчителе тканей РТилй РТ, а при изготовлении производственных серий на коллоидных мельницах типа И - 8 и 1 Ч - 10 с добавлением соленых изотонических растворов Хенкса, Эрла, Тироде или Дульбекко с 0,5%-ным гидролизатом лактальбумина или казеина (рН 7,4 - 7,8) в соотношении 1: 10, Затем в суспензию вносили антибиотики (пенициллин и стрептомицин по 200 кд/мл). После экстрагирования;в течение 1 - 2 ч в суспензию добавляли 5 - 10% хлороформа и смесь эмульгировали на размельчителе тканей или коллоидной мельнице с последующим центрифугированием (сепарированием), В очищенную суспензию добавляли мертиолат 1: 20000.Затем к заранее приготовленной 3%-ной гидроокиси алюминия на солевом растворе Хенкса добавляли вируссодержащую суспензию и проводили сорбцию вируса (с лериодическим встряхиванием - перемешиванием компонентов) в течение 20 - 30 мин (1 - 2 ч), рН смеси (ГОА-суспензия) составляла 7,4 - 7,8; температура 4 - 6 С. По окончании сорбции вируса на гидроокись алюминия температуру смеси доводили до 25 - 26 С и с помощью гликоколового буфера устанавливали р Н, равный 8,6 - 8,8.По достижении указанной температуры и рН смеси при постоянном помешивании к общему объему добавляли 0,05% пятидесятипроцентного раствора формалина (с поправкой на количество формальдегида) и проводили инактивацию вируса в течение 48 ч. После инактивации рН препарата с помощью 5 М раствора соляной кислоты (х. ч.) устанавливали в пределах 7,6 - 7,8 и охлаждали до температуры 4 - 6 С. При указанной температуре производили отстой инактивированного препарата жидкости в количестве 50% от общего объема. К оставшемуся объему концентрированного препарата добавляли 10% глицерина, 0,5% десятипроцентного раствора сапонина и хинозола, Все компоненты перемешивали в течение 20 - 30 мин и готовую вакцину хранили при температуре 4 - 6 С и рН 7,4 - 7,8,8Пропись вакцинь 1 на 1110 л Следующая, л10%-ная вируссодержащая суспензия 14003% -ная гидроокись алюминия 600После удаления надосадочной жидкости вколичестве 1000 л, к оставшемуся объему1000 л концентрированного препарата добавляли, л:Глицерин 100 10 10%-ный сапонин 510%-ный хинозол 5Вакцина представляет собой однороднуюжидкость серовато-зеленого цвета, при хранении которой на дне флакона образуется 15 рыхлый осадок, при встряхивании легко разбивается и вновь превращается в однороднуюравномерную взвесь. 1, Способ получения противоящурной ГОАформолвакцины из лапинизированного вируса, включающий культивирование вируса,приготовление вируссодержащей суспензии,25 ее экстрагирование и эмульгирование, очистку вируса, добавление гидроокиси алюминиядля сорбции вируса и инактивацию его, отл и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышенияиммуногенности и уменьшения ее реактоген 30 ности, вируссодержащую суспензию готовятна солевом изотоническом растворе, например Хенкса, Эрла, Тироде или Дульбекко сдобавлением 0,5%-ного гидролизата лактальбумина или казеина,35 2. Способ по п. 1, отличающийся тем,что к очищенному вирусу добавляют гидроокись алюминия, предварительно приготовленную на соленом изотоническом раствореХенкса.40 Источники информации,принятые во внимание при экспертизе1. Патент ФРГ1161387, кл. 30 116, 1969,45 2, Временная инструкция по изготовлениюи контролю противоящурной концентрированной гидроокисьалюминиевой формолвакцины из лапинизированного вируса Аь25.03.71,3. Тараненко Корректор Л. Брахнина